Cromatografía líquida de alto rendemento
From Wikipedia, the free encyclopedia
A cromatografía líquida de alto rendemento, xeralmente abreviada HPLC (do inglés High-performance liquid chromatography), anteriormente denominada cromatografía líquida de alta presión, é unha técnica de laboratorio de química analítica usada para separar, identificar e cuantificar cada compoñente nunha mestura. A técnica recibe tamén outros diversos nomes na literatura internacional, como cromatografía líquida/de líquidos/en fase líquida de alta eficacia/eficiencia/resolución. A técnica baséase no uso de bombas para facer pasar un solvente líquido presurizado que contén a mestura da mostra a través dunha columna, que está chea dun material adsorbente sólido. Cada compoñente da mostra interacciona de xeito lixeiramente diferente co material adsorbente, causando diferentes velocidades de fluxo para diferentes compoñentes e orixinando a separación dos compoñentes a medida que estes flúen saíndo da columna.
A HPLC foi utilizada para fabricar produtos (por exemplo, durante o proceso de produción de produtos farmacéuticos ou biolóxicos), ten usos legais (por exemplo, para detectar drogas dopantes que aumentan o rendemento ou de abuso en urina), en investigación (por exemplo, separar os compostos dunha mostra biolóxica complexa, ou separar substancias químicas similares unhas das outras), e usos médicos (por exemplo, a detección dos niveis de vitamina D no soro sanguíneo).[1]
Unha cromatografía pode describirse como un proceso de transferencia en masa que implica a adsorción. A HPLC require o uso de bombas para facer pasar un líquido presurizado e a mestura da mostra a través dunha columna chea co adsorbente, o que causa a separación dos compoñentes da mostra. O compoñente activo da columna, o adsorbente, é normalmente un material granular feito de partículas sólidas (por exemplo, sílice, polímeros etc.), dun tamaño de 2 a 50 μm. Os compoñentes da mestura da mostra sepáranse uns dos outros debido aos seus diferentes graos de interacción coas partículas do adsorbente. O líquido presurizado adoita ser unha mestura de solventes (por exemplo, auga, acetonitrilo e/ou metanol) e denomínase "fase móbil". A súa composición e temperatura xogan un papel principal no proceso de separación ao influíren nas interaccións que teñen lugar entre os compoñentes da mostra e o adsorbente. Estas interaccións son de natureza física, como as hidrófobas (dispersivas), dipolo–dipolo e iónicas, ou, máis frecuentemente, unha combinación delas.
A HPLC distínguese da tradicional cromatografía líquida ("de baixa presión") porque as presións ás que opera son significativamente maiores (50–350 bar), mentres que a cromatografía líquida ordinaria normalmente depende da forza da gravidade para que a fase móbil pase a través da columna. Debido á pequena cantidade de mostra separada nunha HPLC analítica, as dimensións dunha columna típica son de 2,1–4,6 mm de diámetro e 30–250 mm de longo. Ademais as columnas de HPLC están feitas con partículas adsorbentes máis pequenas (de 2–50 μm como media de tamaño da partícula). Isto dálle á HPLC un poder de resolución superior (a capacidade de distinguir entre compostos) á hora de separar os compoñentes de mesturas, o que fixo que se convertese nunha técnica cromatográfica moi utilizada.
O esquema dun aparello de HPLC consta normalmente dun desgasificador, mostreador, bombas e un detector. O mostreador leva a mestura da mostra ao fluxo de fase móbil que a transporta pola columna. A bomba introduce o fluxo desexado e a composición da fase móbil na columna. O detector xera un sinal proporcional á cantidade de compoñentes da mostra que saen da columna, polo que permite unha análise cuantitativa dos compoñentes da mostra. Un microprocesador dixital e software de usuario controlan o aparello de HPLC e proporcionan datos da análise. Algúns modelos de bombas mecánicas no instrumento de HPLC poden mesturar múltiples solventes en proporcións que poden cambiar co tempo, xerando un gradiente de composición na fase móbil. Úsanse comunmente varios detectores, como os UV/Vis (ultravioleta/visible), os de matriz de fotodíodos (PDA) ou os baseados en espectrometría de masas. A maioría dos aparellos de HPLC tamén teñen un forno da columna que permite axustar a temperatura á que se produce a separación.