שיבוט מולקולרי
ויקיפדיה האנציקלופדיה encyclopedia
שיבוט מולקולרי הוא סדרה של שיטות בביולוגיה מולקולרית המשמשות להרכבת מולקולות DNA רקומביננטיות ולשכפולן באמצעות פונדקאי. שיבוט מולקולרי נמצא בשימוש נרחב, והכרחי ולשיטות רבות בעולם המדע והרפואה. השימוש במונח שיבוט מתייחס לכך שבתהליך נוצרים עותקי DNA רבים הזהים למקור. שיבוט מולקולרי עושה שימוש לרוב ב-DNA משני מקורות: מאורגניזם אחד משמש כמקור ל-DNA שיעבור שיבוט, ומאורגניזם שני שישמש כפונדקאי לתהליך השכפול. שיבוט מולקולרי מתאפשר כיוון שהמבנה הכימי של DNA, משותף בין כל היצורים החיים. לפיכך מערכת השכפול של הפונדקאי יכולה להתמודד עם DNA זר.
בשיבוט מולקולרי שגרתי, DNA מהאורגניזם הרצוי מעוכל במבחנה על ידי אניזמי הגבלה כדי ליצור מקטעי DNA קצרים. מקטעים אלו מודגרים עם נשא (וקטור), המשמש שלד ליצירת מולקולת DNA מעגלית (פלסמיד). מולקולה רקומביננטית זו מוכנסת לפונדקאי (בדרך כלל מדובר בזן שפיר, קל לגידול של החיידק אי קולי). כחלק מתהליך השכפול הטבעי של הפונדקאי, ישוכפל גם ה-DNA הרקוביננטי. כיוון שמקור ה-DNA הוא זר, חיידקים אלו נחשבים טרנסגניים או אורגניזם מהונדס גנטית (GMO).
תהליך השיבוט המולקולרי מתבסס על העובדה שחיידק יכול לקלוט DNA מעגלי זר, ולשכפלו כחלק מהשכפול הטבעי שלו. מכיוון שחיידקים גדלים בצורה מעריכית, באמצעות שימוש בחיידקים בעלי זמן דור קצר ניתן להגיע בפרק זמן של שעות לעותקים רבים הזהים ל-DNA הרקומביננטי שהוכנס לפונדקאי. נהוג לכנות הן את החיידקים שנוצאו והן את מולקולת ה-DNA הרקוביננטי שיבוטים.
כל מקטע DNA יכול לעבור שיבוט מולקולרי, אך ישנם גורמים שעלולים להגביל את הצלחת התהליך. לדוגמה, רצפי DNA המכילים חזרות הופכיות, מקור שכפול, צנטרומרים וטלומרים. היעילות פוחתת במקטעי DNA ארוכים; אך ניתן לשבט מקטעים מעל 10,000 זוגות בסיסים ועד 40,000 זוגות בסיסים בבקטריופאג'ים כגון בקטריופאג' למדא.
שיבוט מולקולרי דומה לתהליך PCR בכך ששניהם משכפלים רצפי DNA. ההבדל העקרוני בין שתי השיטות הוא ששיבוט מולקולרי נעשה ביצור חי (אין ויוו), ו-PCR נעשה במבחנה (אין ויטרו). מקטע DNA משובט נושא פחות מוטציות מאשר תוצר PCR.