Sito multiplo di clonaggio

Il sito multiplo di clonaggio (in inglese polylinker o multiple cloning site, MCS) è una regione del plasmide nella quale può essere inserito un DNA esogeno (10-11Kb). Molto utile in esperimenti di biologia molecolare, questo DNA può essere inserito grazie all'aiuto di enzimi particolari, detti enzimi di restrizione. Questi enzimi agiscono a livello di una sequenza specifica, detta sito di restrizione, riconoscendola e applicando un taglio al filamento di DNA, generando o estremità "appiccicose" (sticky ends) o estremità "nette" (blunt ends). All'interno del MCS ci sono siti per circa 21 enzimi di restrizione.

I polylinkers trovano applicazione nelle tecniche del DNA ricombinante. In particolare, vengono utilizzati al fine di inserire un cDNA (DNA copiato da mRNA) all'interno del vettore (ad esempio il plasmide).^[1][2] La tecnica prevede i seguenti passi:

1. Aggiunta dei polylinkers ad entrambe le estremità del cDNA, in presenza di ligasi (non ligasi eucariotica poiché non è in grado di saldare doppie eliche, ma solo singoli filamenti; si utilizza ligasi del fago T4 che invece riforma il legame fosfodiesterico a livello di doppia elica)
2. Utilizzo di un enzima di restrizione per la sequenza di interesse contenuta nei polylinkers, oltre che nel vettore. Si ottengono in questo modo estremità appiccicose.