검량선

분석화학에서 검량선, 교정 곡선(calibration curve, 캘리브레이션 커브)은 표준 곡선(standard curve, 스탠더드 커브)이라고도 하며, 미지의 시료를 알려진 농도의 일련의 표준 시료와 비교하여 미지의 시료에 있는 물질의 농도를 결정하는 일반적인 방법이다.^[1] 검량선은 기기 교정 문제에 대한 한 가지 접근 방식이며, 다른 표준 접근 방식은 표준 물질을 미지 시료에 혼합하여 내부 표준을 제공할 수 있다. 검량선은 기기 반응, 즉 분석 신호가 분석물(측정할 물질)의 농도에 따라 어떻게 변하는지를 나타내는 그래프이다.

검출 한계 (LOD), 정량 한계 (LOQ), 동적 범위 및 선형성 한계 (LOL)를 보여주는 검량선 플롯.

일반적인 사용

더 일반적으로 사용되는 검량선은 일부 매개변수를 간접적으로 측정하는 계측기에 대한 곡선 또는 표로, 센서 출력 값의 함수로 원하는 양의 값을 제공한다. 예를 들어, 특정 트랜스듀서 출력(전압)으로부터 인가된 압력을 결정하기 위해 특정 압력 트랜스듀서에 대한 검량선을 만들 수 있다.^[2] 이러한 곡선은 일반적으로 기기가 시료마다 교정값이 다르거나 시간 또는 사용에 따라 변하는 센서를 사용할 때 사용된다. 센서 출력이 일관적이면 기기는 측정 단위로 직접 표시될 것이다.

방법

작업자는 미지 시료에서 예상되는 분석물 농도 범위에 걸쳐 일련의 표준 용액을 준비한다. 표준 용액의 농도는 사용 중인 기술(기기)의 작동 범위 내에 있어야 한다.^[3] 선택된 기술을 사용하여 각 표준 용액을 분석하면 일련의 측정값이 생성된다. 대부분의 분석에서 기기 반응 대 농도 그래프는 선형 관계를 보여준다. 작업자는 미지 시료의 반응을 측정하고 검량선을 사용하여 보간법으로 분석물의 농도를 찾을 수 있다.

다른 농도의 단백질에 대한 흡광도를 보여주는 표준 곡선의 예시(각 측정에 대해 두 번의 시도). 다른 시료의 단백질 질량은 표준 곡선에서 어디에 해당하는지를 결정하여 확인한다. 이 경우 30밀리그램이다.

데이터(각 표준 용액에 대한 분석물의 농도와 기기 반응)는 선형 회귀 분석을 사용하여 직선에 맞출 수 있다. 이는 y = mx + y₀ 방정식으로 설명되는 모델을 생성하며, 여기서 y는 기기 반응, m은 감도를 나타내고 y₀는 배경을 설명하는 상수이다. 미지 시료의 분석물 농도(x)는 이 방정식을 통해 계산할 수 있다.

다양한 변수를 분석 신호로 사용할 수 있다. 예를 들어, 크로뮴 (III)은 검출기로 광전 증폭관 (PMT)이 포함된 기기에서 화학발광 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 검출기는 시료에서 생성된 빛을 전압으로 변환하며, 이는 빛의 강도에 따라 증가한다. 측정된 빛의 양이 분석 신호이다.

예시

브래드퍼드 분석법으로 처리된 시료. 갈색 시료(낮은 흡광도)는 단백질을 포함하지 않는 반면, 파란색 시료(높은 흡광도)는 단백질을 포함한다. 두 번째 시료의 단백질 양은 표준 곡선과 비교하여 결정할 수 있다.

브래드퍼드 분석법은 단백질 농도를 측정하는 색소비색법이다. 시약인 쿠마시 브릴리언트 블루는 단백질에 존재하는 아르기닌과 방향족 아미노산에 결합하면 파란색으로 변하여 시료의 흡광도를 증가시킨다. 흡광도는 분광광도계를 사용하여 파란색 염료의 최대 흡광 주파수(A_max, 595 nm)에서 측정한다. 이 경우 흡광도가 높을수록 단백질 농도가 높다.

알려진 농도의 단백질 데이터를 사용하여 표준 곡선을 만드는데, X축에 농도를, Y축에 분석 측정값을 표시한다. 그런 다음 미지 농도의 시료로 동일한 분석을 수행한다. 데이터를 분석하려면 미지 물질의 분석 측정값에 해당하는 Y축의 측정값을 찾고, 선을 따라 표준 곡선과 교차하는 지점까지 이동한다. X축의 해당 값은 미지 시료의 물질 농도이다.^[4][5]

오차 계산

예상대로, 미지 농도에는 아래 공식으로 계산할 수 있는 약간의 오차가 발생한다.^[6][7][8] 이 공식은 모든 표준 용액에 대해 선형 관계가 관찰된다고 가정한다. 미지 시료의 신호가 모든 표준 용액 신호의 중간에 위치하면 농도 오차가 최소화된다는 점에 유의하는 것이 중요하다(만약 ${\displaystyle y_{\text{unk}}={\bar {y}}}$ 이면 ${\displaystyle y_{\text{unk}}-{\bar {y}}}$ 항은 0이 된다).

$${\displaystyle s_{x}={\frac {s_{y}}{|m|}}{\sqrt {{\frac {1}{n}}+{\frac {1}{k}}+{\frac {(y_{\text{unk}}-{\bar {y}})^{2}}{m^{2}\sum _{i}{(x_{i}-{\bar {x}})^{2}}}}}}}$$

• ${\displaystyle s_{y}={\sqrt {\frac {\sum _{i}{(y_{i}-mx_{i}-b)}^{2}}{n-2}}}}$는 잔차의 표준 편차이다.
• ${\displaystyle m}$은 선의 기울기이다.
• ${\displaystyle b}$는 선의 y-절편이다.
• ${\displaystyle n}$은 표준 용액의 개수이다.
• ${\displaystyle k}$는 반복 미지 시료의 개수이다.
• ${\displaystyle y_{\text{unk}}}$는 미지 시료의 측정값이다.
• ${\displaystyle {\bar {y}}}$는 표준 용액 측정값의 평균이다.
• ${\displaystyle x_{i}}$는 표준 용액의 농도이다.
• ${\displaystyle {\bar {x}}}$는 표준 용액 농도의 평균이다.

장점과 단점

대부분의 분석 기술은 검량선을 사용한다. 이 접근 방식에는 여러 가지 장점이 있다. 첫째, 검량선은 검량선으로부터 계산된 농도의 불확실성을 (데이터에 적합된 최소제곱법 선형 통계를 사용하여) 계산하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다.^[9][10]

둘째, 검량선은 경험적 관계에 대한 데이터를 제공한다. 분석물에 대한 기기 반응 메커니즘은 일부 이론적 모델에 따라 예측되거나 이해될 수 있지만, 대부분의 이러한 모델은 실제 시료에 대해 제한적인 가치를 가진다. (기기 반응은 일반적으로 분석물의 상태, 사용된 용매 및 포함될 수 있는 불순물에 크게 의존하며, 압력 및 온도와 같은 외부 요인의 영향을 받을 수도 있다.)

형광과 같은 많은 이론적 관계는 하나 이상의 참조 표준 분석을 통해 기기 상수를 결정해야 한다. 검량선은 이 접근 방식의 편리한 확장이다. 특정 (유형의) 시료에 있는 특정 분석물에 대한 검량선은 해당 특정 측정에 필요한 경험적 관계를 제공한다.

주요 단점은 (1) 표준 용액에 분석물질, 가급적 고순도 및 알려진 농도의 공급원이 필요하다는 점과 (2) 표준 용액과 미지 시료가 동일한 매트릭스에 있어야 한다는 점이다. 특정 단백질과 같은 일부 분석물은 순수한 형태로 충분한 양을 얻기가 극히 어렵다. 다른 분석물은 종종 연못 물에 있는 중금속과 같은 복잡한 매트릭스에 존재한다. 이 경우 매트릭스가 분석물의 신호를 방해하거나 약화시킬 수 있다. 따라서 (방해 화합물이 없는) 표준 용액과 미지 시료 간의 비교는 불가능하다. 표준 첨가법은 이러한 상황을 처리하는 방법이다.

응용 분야

• 농도 분석
• 분석 기기 또는 센서 장치(예: 이온 선택성 전극)의 적절한 기능 확인
• 대조군 처리의 기본 효과 결정 (예: 클로노제닉 분석에서 용량-생존 곡선)

같이 보기

• 색
• 곡선 맞춤
• 선형 회귀
• 로그 눈금
• 단백질
• 계열 희석