Polymerasekettingreactie

De polymerasekettingreactie of PCR (polymerase chain reaction), is een laboratoriumtechniek waarmee een specifiek stukje DNA vele malen kan worden vermenigvuldigd (geamplificeerd). Uit een uiterst kleine hoeveelheid materiaal kan via PCR voldoende DNA worden verkregen voor verdere analyse. Sinds de ontwikkeling in de jaren 1980 door biochemicus Kary Mullis is PCR uitgegroeid tot een van de belangrijkste technieken in de moleculaire biologie.

Principe van PCR. Het DNA wordt kortstondig verhit tot ongeveer 95°C zodat de strengen uit elkaar gaan (denaturatie). Dan wordt het DNA afgekoeld zodat de primers kunnen hechten aan de randen van het te vermenigvuldigen fragment (annealing). Vervolgens wordt verwarmd tot de optimale temperatuur van de polymerase (elongatie). Na vele cycli is het stukje DNA van interesse miljoenen keer gekopieerd.

PCR wordt breed toegepast in zowel fundamenteel onderzoek als in praktische domeinen zoals medische diagnostiek, forensisch onderzoek, genetische modificatie en infectieziektebestrijding. Dankzij PCR kunnen bijvoorbeeld virussen zoals HIV of SARS-CoV-2 worden opgespoord in een vroege infectiefase, wanneer er nog weinig genetisch materiaal aanwezig is. Ook wordt de techniek gebruikt om DNA-profielen te maken bij gerechtelijk onderzoek of om genetische mutaties op te sporen bij erfelijke aandoeningen.

De kracht van PCR ligt in het vermogen om uiterst nauwkeurig een specifiek DNA-fragment te vermenigvuldigen. Dit gebeurt met behulp van een enzym, DNA-polymerase, dat een nieuwe streng bouwt op basis van een bestaande DNA-template. Hierbij worden korte synthetische stukjes DNA, zogeheten primers, gebruikt om het beginpunt aan te geven. Het principe van PCR is gebaseerd op het herhaaldelijk verhitten en afkoelen van het DNA, die het DNA afwisselend denatureren, primers laten binden en nieuwe strengen laten vormen.

Toepassingen

Thermocycler voor PCR

• Bij tal van infectieziekten is PCR mogelijk om de ziekteverwekker aan te tonen, PCR is eerder positief dan serologie en geeft sneller resultaat dan een kweek. Voorbeelden: parasieten, kinkhoest, tuberculose. Ook het overgrote deel van de testen voor het virus SARS-CoV-2, dat COVID-19 veroorzaakt, gebeurt met PCR.
• Een bioloog of biochemicus wil vaak een stuk DNA van een bestaand organisme multipliceren (of iets wat er sterk op lijkt). Het origineel kan als voorbeeld dienen.
• Bij een forensisch onderzoek vindt men het voorbeeld (bijvoorbeeld een bloedvlek) op de plaats van een misdrijf.
• Bij onderzoek naar de authenticiteit van levensmiddelen wordt de techniek toegepast om de aanwezigheid van genetisch gemanipuleerde organismen (ggo) aan te tonen.

Het kleine beginnetje kan men volgens de traditionele methode maken, als men tenminste weet waar de gewenste DNA-sequentie mee begint en waarmee hij eindigt. Deze stukjes noemt men primers.

Werking van de reactie

De reactie bestaat uit drie fasen:

1. Denaturatie: gedurende deze fase wordt al het DNA dat als dimeer in de oplossing aanwezig is, gesplitst door een verhoogde temperatuur: de dubbele helix valt uit elkaar.
2. Hybridisatie: het grote, logge, voorbeeld-DNA krijgt bij lage temperatuur even de tijd om met de snel mobiele primers in de oplossing te hybridiseren. Het krijgt niet genoeg tijd om de denaturatie ongedaan te maken.
3. Elongatie: het polymerase begint vanaf de gebonden primers bij gemiddeld hoge temperatuur het enkelstrengig DNA aan te vullen tot dubbelstrengig DNA.

Na de derde stap bevat de oplossing tweemaal zoveel van het gewenste DNA als ervoor. Door de stappen een aantal malen (bijvoorbeeld 30) te herhalen, krijgt men een exponentiële groei van de hoeveelheid gewenst DNA.

Omdat het polymerase alleen richting de doelsequentie kopieert, wordt dit stukje exponentieel gekopieerd, terwijl ander DNA al bij de derde cyclus niet meer gekopieerd wordt. Hierdoor zijn er na dertig cycli miljarden kopieën van de doelsequentie en nog steeds maar een heel klein beetje ander DNA.

Het DNA-polymerase van (de bacterie) Thermus aquaticus of van Pyrococcus furiosus, die onder andere in warmwaterbronnen en geisers leven, wordt gebruikt omwille van de thermostabiliteit. Tijdens de verschillende cycli van een PCR worden namelijk herhaaldelijk temperaturen bereikt die polymerases van niet thermofiele organismen doen denatureren.

Primers

Een primer is een klein stukje enkelstrengs-RNA of -DNA dat gebruikt wordt als startpunt van de PCR. Er zijn steeds twee primers nodig, een voor de 5'-streng en een voor de 3'-streng. De beste primer voor PCR is een relatief korte RNA-streng. Deze streng wordt kunstmatig gemaakt met een RNA-polymerase. De RNA-streng wordt dan door DNA-polymerase omgezet in een korte enkelstrengs-DNA. De DNA-streng is zo kort dat deze zich vanzelf aan een ander complementair stuk enkelstrengs-DNA hecht en zo het startpunt vormt voor de replicatie. Een goede primer is niet te kort, omdat daarmee de specificiteit wordt benadeeld. Een te lange primer heeft theoretisch een hogere specificiteit, maar zou secundaire structuren kunnen vormen waardoor de PCR niet of nauwelijks nog effectief is.

Vanaf de primer wordt het DNA richting 3' gekopieerd. DNA wordt altijd van 5' naar 3' gebouwd.

Schematisch

PCR-schema

1. Door het DNA te verhitten tot tussen de 90 en 96 °C gaan de twee strengen uit elkaar (denaturatie)en ontstaan twee matrijzen.
2. Vervolgens hechten de primers zich bij een temperatuur tussen de 45 en 65 °C door de langzaam dalende temperatuur aan de twee enkelvoudige DNA-strengen.
3. Bij 72 °C wordt door DNA-polymerase de primer richting 5' verlengd, waardoor er twee stukken dubbele DNA-strengen ontstaan.
4. Nu worden deze stukjes weer door verhitting gesplitst in enkelstrengs-DNA enz. Daar de aanwezige primers voorkeursparing hebben met de twee stukken enkelstrengs-DNA die een verlenging zijn van deze primers worden alleen deze DNA-stukken gerepliceerd. Na enkele cycli is er zo veel DNA aangemaakt dat deze aangetoond kan worden met gelelektroforese.

Praktisch

Een mengsel van DNA-monster, DNA-polymerase, twee specifieke primers (5' en 3'), dNTP's (een algemene term voor de vier deoxyribonucleotides: dATP, dCTP, dGTP en dTTP ook wel oligonucleotiden genoemd), een buffer en magnesiumchloride. Er wordt gebruikgemaakt van een thermostabiel polymerase-enzym, zoals Taq-polymerase, dat een optimale temperatuur van ongeveer 72 °C heeft. De buffer zorgt voor een optimale pH en zoutconcentratie. Magnesiumchloride is de cofactor voor de binding tussen DNA-polymerase, DNA en NTP waarmee de snelheid van het proces tegenover de nauwkeurigheid kan worden uitgebalanceerd.

De rest van het proces is een kwestie van goed getimede temperatuursveranderingen. Als voorbeeld de procedure voor menselijk DNA met Taq-polymerase:

• De denaturatiefase wordt uitgevoerd bij 94 °C, hierbij worden de beide DNA-strengen gescheiden
• De hybridisatie bij 45-65 °C, annealing van de oligonucleotiden en primers
• Voor de extensie van de keten (elongatie) wordt de temperatuur weer opgevoerd tot 72 °C, waarbij de oligonucleotiden dienen als primer voor de taq-polymerase

Hierna wordt het proces 30-40 keer herhaald.

Realtime-PCR

Bij de realtime-PCR-methode, ook wel kwantitatieve of kinetische PCR-methode (qPCR) genoemd, kan tijdens de PCR het DNA al worden aangetoond; dit is een snelle methode voor het opsporen van micro-organismen. Realtime-PCR maakt zowel het aantonen (detectie) als kwantificering van een of meer specifieke nucleïnezuurvolgorden (sequenties) in het DNA-monster mogelijk.

Gelabelde probes binden aan een specifiek stuk DNA en zijn niet waar te nemen als de probe intact is. Zodra de polymerasekettingreactie op gang komt, wordt de probe afgebroken en wordt het label zichtbaar. Fluorescerende labels gaan licht van een bepaalde golflengte uitzenden. Hoe meer DNA wordt omgezet, des te sterker het signaal. Dat signaal, uitgedrukt in RFU's (Relative Fluorescent Unit), wordt grafisch uitgezet tegen de thresholdcyclus (drempelwaarde, aangeduid met Ct-waarde), de cyclus in het PCR-proces waarbij de excitatie van het licht dat vrijkomt van het label boven de detectiegrens uitkomt. Omdat er bij qPCR's ook standaarden worden meegenomen waarvan de hoeveelheid DNA bekend is, kan er een ijklijn worden geplot. Uit deze lineaire grafiek wordt de hoeveelheid DNA berekend, door de thresholdcyclus af te zetten tegen de excitatie.

PCR-ELISA

De PCR-ELISA-test is een goedkoper alternatief van de realtime-PCR-methode.

Geschiedenis en gebruik

De reactie is bedacht in 1983 door Kary Mullis en wordt o.a. gebruikt bij het aantonen en analyseren van kleine aantallen bacteriën en virussen en bij het opwerken van sporen sperma of andere lichaamscellen (haarwortels, bloedcellen) door daders bij misdaden op het slachtoffer achtergelaten.

Vervuiling van gewassen met ggo-stuifmeel kan sinds 2005 gedetecteerd worden met een gevoeligheid van 1 op 20.000 ofwel 0,005%. Rond 2000 was de detectielimiet nog 1,0-0,1%.

Toepassing tijdens de coronapandemie

In verschillende landen, waaronder België, werd de PCR-test uitgebreid ingezet voor het detecteren van SARS-CoV-2, dat COVID-19 veroorzaakt. De uitslag kon leiden tot verplichte quarantaine of andere maatregelen die tijdens de coronapandemie werden getroffen.