Концепция трёх R

Три R (3R) (замена (replacement) - сокращение (reduction) - уточнение (refinement)) — руководящие принципы более этичного использования животных в тестировании продуктов и научных исследованиях. Впервые они были описаны У. М. С. Расселом и Р. Л. Берчем в 1959 году^[1]. В 3R входит:

1. Замена (Replacement): методы, при которых избегается или чем-то заменяется использование животных в исследованиях
2. Сокращение (Reduction): использование методов, которые позволяют исследователям получать сопоставимые уровни информации от меньшего количества животных или получать больше информации от того же количества животных.
3. Усовершенствование (Refinement): использование методов, которые облегчают или минимизируют потенциальную боль, страдания или дистресс, а также улучшают благополучие используемых животных.

Лабораторная крыса

3R не просто поощрение альтернатив испытаниям на животных, эти принципы направлены на улучшение благополучия животных и повышения качества науки там, где использования животных нельзя избежать. В настоящее время 3Rs ассоциируются с методами, позволяющими сократить количество животных и минимизировать их потенциальные боль и страдания в биомедицинских исследованиях.

Методы in vitro считаются более совершенными не только благодаря своей высокой специфичности и точности, но и за счет меньших финансовых затрат и сокращения сроков испытаний. Однако замена тестов для контроля качества партий биологических лекарственных препаратов при выпуске, как правило, затруднительна. Основные препятствия для внедрения альтернативных методов: отсутствие гармонизации регуляторных требований, сложность подтверждения корреляции между методами in vivo и in vitro, в том числе при проведении сравнительных исследований, проблемы при внесении регуляторных изменений и др.^[2].

Замена

Распространённое заблуждение о 3R состоит в том, что они относятся только к замене^[3], однако их область применения гораздо шире.

В оригинальной книге 3R были произвольно ограничены позвоночными. Рассел и Берч оценивали возможность страдания по чувственности (Sentience). Они использовали термин «техника замещения» для любого научного метода, использующего неразумный материал, для замены методов, использующих сознательных живых позвоночных^[1]. Этот неразумный материал включал высшие растения, микроорганизмы и многоклеточных эндопаразитов, которые, по утверждениям авторов, имели почти атрофированные нервную и сенсорную системы. Рассел и Берч назвали «сравнительной заменой» возможную замену позвоночных субъектов на беспозвоночных. Рассел и Берч также рассматривали уровни замещения. При «относительном замещении» животные по-прежнему необходимы, хотя во время эксперимента они, вероятно или наверняка, не подвергаются никакому стрессу. При «абсолютной замене» животные вообще не требуются ни на каком этапе.

Стратегии замены включают в себя:

1. Культуры тканей
2. Перфузионные органы
3. Срезы тканей
4. Клеточные фракции
5. Субклеточные фракции

Более поздние интерпретации принципа замещения предполагают предпочтительное использование методов, не связанных с животными, когда это возможно для достижения тех же научных целей, то есть беспозвоночные не считаются подходящей заменой позвоночным. Однако, например, Национальный центр замены, усовершенствования и сокращения животных в исследованиях (NC3R) выступает за использование некоторых беспозвоночных в исследованиях с заменой^[4]. Следовательно, термин «замещение» может относиться к использованию предположительно менее разумных видов^[5], как в «относительном замещении».

Рассел и Берч не могли предвидеть некоторые технологии, появившиеся к 2020-м годам. Одна из этих технологий, трёхмерные клеточные культуры, также известная как органоиды или мини-органы, заменила животных в некоторых видах исследований. Учёные из Университета Джонса Хопкинса разработали органоиды мини-мозга, чтобы смоделировать, как COVID-19 может повлиять на мозг^[6]. Исследователи использовали органоиды головного мозга, чтобы смоделировать, как вирус Зика нарушает развитие мозга плода. Опухоли — трёхмерные клеточные культуры, полученные из клеток, взятых при биопсии у пациентов-людей — можно использовать для изучения геномики и лекарственной устойчивости опухолей в различных органах. Органоиды также используются при моделировании генетических заболеваний, таких как муковисцидоз^[7], нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, инфекционных заболеваний, таких как MERS-CoV и норовирус, и паразитарных инфекций, таких как Toxoplasma gondii^[8]. Органоиды, полученные из клеток человека и животных, также широко используются в фармакологических и токсикологических исследованиях^[9][10].

Сокращение

Сокращение относится к методам, которые сводят к минимуму количество животных, используемых для исследования^[4]. Рассел и Берч предположили, что сокращения количества используемых животных можно добиться несколькими способами. Одним из основных способов, благодаря которым может произойти значительное сокращение, является правильный выбор стратегии при планировании и выполнении целых направлений исследований. Второй метод заключается в контроле вариаций среди животных, используемых в исследованиях, а третий метод заключается в тщательном планировании и анализе исследований. С появлением, развитием и доступностью компьютеров в статистическом анализе можно использовать большие наборы данных, тем самым уменьшая количество используемых животных. В некоторых случаях, используя ранее опубликованные исследования, можно полностью избежать использования животных, избегая ненужного повторения. Современные методы визуализации в сочетании с новыми методами статистического анализа также позволяют сократить количество используемых животных, например, предоставляя больше информации о каждом животном^[11][12].

Усовершенствование

Рассел и Берч писали: «Предположим, что для определённой цели мы не можем использовать методы замещения. Предположим, мы договорились, что будем использовать все средства теории и практики, чтобы свести к минимуму количество животных, которых мы должны использовать. Именно в этот момент начинается усовершенствование, и его цель состоит в том, чтобы просто свести к абсолютному минимуму количество страданий, причиняемых тем животным, которые все ещё используются»^[1]. Методы усовершенствования могут включать^[13]:

• Неинвазивные методы
• Адекватная анестезия и анальгетики для облегчения боли
• Обучение животных добровольному участию в процедурах (например, в заборе крови), чтобы они лучше контролировали процедуру, уменьшали стресс.
• Предоставление подходящего для вида жилья и обогащение окружающей среды, которые отвечают физическим и поведенческим потребностям животных (например, предоставление возможностей для гнездования грызунов).

Определение усовершенствования развилось из определения, данного Расселом и Берчем. Принцип был усовершенствован Тацудзи Номурой, директором Центрального института экспериментальных животных в Японии^[14]. К 2020-м годам общепринятым является новое определение: это любой подход, который позволяет избежать или свести к минимуму реальную или потенциальную боль, дистресс и другие неблагоприятные эффекты, испытываемые в любой момент жизни животных, и который улучшает их благополучие^[15]. Усовершенствование охватывает не только прямой вред, связанный с использованием животных, но и косвенный или случайный вред, связанный с разведением, транспортировкой, содержанием и животноводством.

Сравнение методов in vivo и in vitro

При контроле качества традиционных вакцин (дифтерия, столбняк, коклюш) тесты in vivo ранее преобладали из-за ограниченности методов in vitro. Современные иммунохимические и клеточные технологии теперь позволяют точнее оценивать параметры качества. Ключевые проблемы тестов in vivo^[2]:

• Высокая вариабельность (напр., тест активности вакцины против бешенства допускает разброс 25-400% против 93-107% при использовании иммуноферментного анализа)
• Этические вопросы (причинение боли и страданий лабораторным животным)
• Экономическая неэффективность (более дорогостоящие, тесты длятся недели/месяцы)
• Ложные результаты при контроле на наличие посторонних вирусов при характеристике банков клеток и внутрипроизводственном контроле партий биологических лекарственных препаратов (метод секвенирования нового поколения NGS демонстрирует бо́льшую чувствительность, чем в испытаниях in vivo)

Методы in vitro обеспечивают:

• Более строгий контроль производственного процесса
• Снижение ложноположительных результатов
• Соответствие принципам 3R (Replacement, Reduction, Refinement)

Хотя альтернативные методы активно развиваются, их применение ограничено случаями, когда модели in vitro не обеспечивают достаточной прогностической ценности для оценки из-за сложности моделирования системного действия препаратов и требований регуляторных органов к подтверждению безопасности, что требует сохранения тестов на животных^[2].

Методы in silico в реализации принципов 3R

Методы машинного обучения (ML) и компьютерного моделирования (in silico), такие как анализ зависимостей «структура–активность», является важным инструментом реализации принципов 3R и играют ключевую роль в оценке безопасности фармакологически активных веществ на ранних стадиях разработки лекарственных препаратов. Использование этих методов позволяет прогнозировать потенциальные токсические и побочные эффекты, метаболизм, взаимодействие с мишенями и другие фармакокинетические и фармакодинамические характеристики, что значительно сокращает риски и затраты на дальнейшие доклинические и клинические исследования. Обзор современных методов in silico, включая регрессионные и классификационные подходы, а также сравнение консенсусным методом и нейросетевыми моделями показал, что искусственные нейронные сети являются наиболее перспективным и эффективным методом для компьютерного прогнозирования токсикологических и фармакокинетических характеристик (ADMET - Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, Toxicity) лекарственных соединений. Нейросетевые модели превосходят другие методы по точности прогноза, особенно для таких параметров, как канцерогенность, генотоксичность, проникновение через гематоэнцефалический барьер, всасываемость в желудочно-кишечном тракте и печеночный клиренс. Это делает их ценным инструментом для доклинических исследований, позволяя сократить затраты времени и ресурсов на экспериментальные испытания^[16][17].

История

В 1954 году Федерация университетов по защите животных (UFAW) решила спонсировать систематические исследования прогресса гуманных лабораторных методов^[18]. В октябре того же года Уильям Рассел, известный молодой зоолог, и Рекс Берч, микробиолог, получили назначение и начали систематическое изучение лабораторных методов в их этических аспектах. В 1956 году они подготовили общий отчёт для комитетов Федерации, и этот отчёт лёг в основу книги, которая была завершена в начале 1958 года. Большую часть времени они работали со специальным Консультативным комитетом под председательством профессора Питера Медавара.

В качестве вклада в празднование столетия «Происхождения видов» все цитаты в начале каждой главы взяты из работ Чарльза Дарвина.

Современное состояние вопроса

По состоянию на 2025 год испытания in vivo применяются на разных этапах жизненного цикла биологических лекарственных препаратов: разработка (оценка биологических свойств и безопасности), внутрипроизводственный, выпускающий, регистрационный и пострегистрационный контроли (оценка критических показателей качества (critical quality attribute, CQA), таких как активность и безопасность). Важность замены тестов in vivo признана европейскими и международными регуляторными органами. В поддержку реализации программы 3Rs опубликовано несколько нормативных документов ^[19][20][21].

В 2019 г. Экспертный комитет по биологической стандартизации (Expert Committee on Biological Standardisation, ECBS) предложил проект по пересмотру документов, касающихся биологических лекарственных препаратов, чтобы гармонизировать их с положениями концепции 3Rs и таким образом ускорить внедрение разработанных и научно обоснованных методов in vitro на этапе контроля качества при выпуске.

В 2024 г. из Европейской фармакопеи исключены 3 общие главы, описывающие испытания на животных, такие как 2.6.8. «Пирогены» (испытания на кроликах), 2.6.10. «Гистамин» (испытания на морских свинках) и 2.6.11. «Депрессорные вещества» (испытания на кошках). Вместе с исключением общей главы 2.6.9. «Аномальная токсичность» в 2017 г., из Европейской фармакопеи исключены все общие испытания по оценке безопасности биологических лекарственных препаратов на животных. Данное решение вступит в силу с 1 января 2026 г. Программа биологической стандартизации Европейской фармакопеи, в рамках которой проводятся исследования по валидации новых фармакопейных методов и созданию референтных препаратов для контроля качества биологических лекарственных средств, содействует применению подхода 3Rs. До настоящего времени 25 проектов из 170 были посвящены разработке или внедрению альтернативных методов без использования животных. В Европейскую фармакопею в 2019 г. включена общая глава 5.2.14 «Замена метода(ов) in vivo методом(ами) in vitro для контроля качества вакцин» (10-е издание), а также соответствующие главы были включены в Британскую фармакопею (2019 г.) и Фармакопею Евразийского экономического союза (2024 г.)^[2].

Международные и национальные организации, занимающиеся реализацией концепции 3Rs

Принципы 3Rs включены в нормативные акты и руководства по проведению исследований на животных. Данный подход отражается в рекомендациях ВОЗ, международных документах, таких как Европейская директива 2010/63/EU^[20], ряде национальных законодательных актов, правилах и руководствах, действующих по всему миру^[2].

• Рабочая группа по вакцинам Европейского директората по качеству лекарственных средств и здравоохранению (European Directorate for the Quality of Medicines and Healthcare's Vaccines Working Group (EDQM))
• Национальный центр Великобритании по замене и сокращению животных в исследованиях (National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research, NC3Rs)
• Европейская референс-лаборатория по альтернативным методам испытаний на животных (European Union Reference Laboratory for alternatives to animal testing (EURL ECVAM))
• Европейская сеть лабораторий по валидации альтернативных методов (European Union Network of Laboratories for the Validation of Alternative Methods (EU-NETVAL))
• Национальный институт здравоохранения, США (National Institutes of Health (NIH), USA)
• Межведомственный центр по оценке альтернативных токсикологических методов, США (Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), USA)
• Индийская фармакопейная комиссия по замене испытаний in vivo (Indian Pharmacopoeia Commission (IPC) on replacement of in vivotesting)
• Китайский центр развития сельских технологий Министерства науки и технологий (China Rural Technology Development Centre of the Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China)
• Национальный консультативный комитет по исследованиям на лабораторных животных, Сингапур (National Advisory Committee for Laboratory Animal Research (NACLAR), Singapore)
• Международный исследовательский проект Консорциума VAC2VAC (International research project of the VAC2VAC Consortium)
• Ассоциация по оценке безопасности без использования животных при Обществе защиты животных (Animal-Free Safety Assessment Association (AFSA), Humane Society International (HSI))

Критика

Критика принципов связана с пониманием и реализацией различных аспектов подхода^[22]. Разные заинтересованные стороны (например, экспериментаторы на животных, представители учреждений, политики, активисты и общественность) могут по-разному интерпретировать 3R^[22][23]. Принципы при этом не затрагивают некоторые вопросы, сосредоточены на гуманном обращении с животными, а не на этике их использования^[22].

Отмечается, что продвижение принципов не привело к сокращению количества животных, используемых в экспериментах^[24][25]. Однако эта критика может быть результатом неправильного понимания принципа «сокращение» — он касается не абсолютного сокращения количества используемых животных, а сокращения количества животных, используемых в одном исследовании. Трудно оценить количество животных, не используемых в научных процедурах в результате методов замены или сокращения, но количество проводимых медицинских исследований растёт быстрее, чем количество используемых животных^[26].

В обзоре десятков статей, посвященных мышам в продолжительных экспериментах с болью, исследователи обнаружили, что в них не было упоминаний 3R, что может говорить о том, что исследователи не знают об этих принципах или равнодушны к ним^[27]. После обзора качества экспериментального дизайна в опубликованных журнальных статьях^[28] среди прочего было обнаружено, что использование принципов 3R и отчёты об этом были спорадическими. В результате в 2010 году были разработаны и опубликованы рекомендации ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments)^[29] — список из 20 пунктов, которые должны быть указаны в публикациях, описывающих научные исследования с использованием животных. Многие журналы стали требовать от авторов соблюдения рекомендаций ARRIVE при подготовке рукописей^[30], но последующий обзор, опубликованный в 2014 году, показал, что уровень отчётности по некоторым элементам исследований по-прежнему остаётся низким^[31].

В ходе опроса португальских учёных, недавно прошедших обучение по 3R, исследователи обнаружили, что «на удивление большое количество исследователей не знали о принципе 3R, даже те, кто работал с животными более 10 лет». Обучение 3R «не изменило представления о текущих и будущих потребностях в использовании животных в исследованиях», но расширило знания о применении 3R^[32]. Авторы обнаружили, что проводимое ими обучение «по-видимому, мало влияет на принятие исследователями замещающих альтернатив использованию животных»^[32].