Мотив (молекулярная биология)

Моти́в в молекулярной биологии это группа относительно коротких последовательностей нуклеотидов или аминокислот, обладающих достаточным сходством вследствие выполнения ими одной биологической функции, например, связывания одного транскрипционного фактора, и, как следствие, слабо меняющияся в процессе эволюции ^[1][2][3]. Таким образом, под мотивом подразумевают не конкретную последовательность, а каким-либо образом описанный спектр последовательностей, каждая из которых способна выполнять определённую биологическую функцию данного мотива^[4].

Мотивы встречаются в живых организмах повсеместно и выполняют множество жизненно важных функций, таких как регуляция транскрипции и трансляции (в случае нуклеотидных мотивов), посттрансляционная модификация и клеточная локализация белков, и частично обуславливают их функциональные свойства (лейциновая молния)^[2][5]. Они широко используются в биоинформатике для предсказания функций генов и белков, построения карт регуляции, важны для многих задач генной инженерии и молекулярной биологии в целом^[6][7][8].

В связи с практической важностью мотивов, разработаны как биоинформатические методы их поиска (MEME, Gibbs Sampler), так и методы поиска мотивов in vivo (ChIP-seq, ChIP-exo). Последние довольно часто дают приблизительные координаты мотивов и их результаты затем уточняются биоинформатическими методами^[1][2][6].Для удобства хранения мотивов в базах данных используются их разные, отличающееся степенью детальности, представления, наиболее распространенными из которых являются консенсус и позиционная весовая матрица^[2].

Следует отличать мотив от консервативных участков в близкородственных организмах, необладающих значимыми биологическими функциями, где мутационный процесс не успел ещё достаточно их изменить^[9].

Мотивы в нуклеиновых кислотах

В случае с ДНК чаще всего мотивы представляют собой короткие последовательности, являющиеся сайтами связывания для белков, таких, как нуклеазы и транскрипционные факторы, или вовлечённые в важные регуляторные процессы уже на уровне РНК, такие как посадка рибосомы, процессинг мРНК и терминация транскрипции^[4].

Краткая история изучения

Изучение мотивов в ДНК стало возможным благодаря появлению в 1973 году^[10] процедуры секвенирования ДНК (определения последовательности нуклеотидов фрагмента ДНК). Первыми были определены последовательности lac-оператора и лямбда-оператора^[11]. Однако до появления более производительных методов секвенирования^[12], количество последовательностей мотивов оставалось достаточно малым. К концу 1970-х годов появилось множество примеров мутантных последовательностей (сайтов), связывающих транскрипционные факторы и последовательностей с изменённой специфичностью^[13]. С увеличением количества последовательностей, стали развиваться и методы теоретического предсказания мотивов. В 1982 году была впервые сконструирована позиционно-весовая матрица (ПВМ) мотива сайта инициации трансляции. С помощью построенной ПВМ были предсказаны другие сайты инициации трансляции^[14]. Этот подход оказался достаточно мощным и до сих пор в разных формах применяется для поиска известных мотивов в геномах, а конкретные методы различаются только видом весовой функции^[4]. Однако подход, основанный на построении ПВМ на базе уже имеющихся последовательностей, не позволял находить принципиально новые мотивы, что является более сложной задачей. Первый алгоритм, решавший эту задачу, был предложен Галласом с коллегами в 1985 году^[15]. Этот алгоритм был основан на поиске общих слов в наборе последовательностей и давал большой процент ложноотрицательных результатов, однако он стал основой для целого семейства алгоритмов^[16]. Позднее были разработаны более точные вероятностные методы: алгоритм MEME, основанный на процедуре максимизации ожидания^[17] и алгоритм Gibbs Sampler, также основанный на процедуре максимизации ожидания^[18]. Оба метода оказались очень чувствительными и используются в настоящее время для предсказания мотивов в наборах последовательностей.

После разработки мощных средств для предсказания мотивов связывания транскрипционных факторов и установления соответствия между достаточным количеством транскрипционных факторов и мотивов, стало возможным предсказывать функции оперона, лежащего поблизости от мотива по специфичности транскрипционного фактора, с ним связывающегося и наоборот, предсказывать транскрипционный фактор по генам в опероне, лежащем рядом с определённым мотивом^[3].

Сайты связывания

Регуляция транскрипции

Характерными примерами регуляции транскрипции, осуществляемой с помощью белка, распознающего специальный мотив, являются:

1. Сайт пуринового репрессора PurR у Escherichia coli. PurR связывается с последовательностью в 16 нуклеотидов, которая расположена перед пуриновым опероном и регулирует транскрипцию генов, ответственных за синтез пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов^[5][19]. Интересно, что у бактерии Bacillus subtilis, эволюционно далёкой от кишечной палочки, также есть пуриновый репрессор, не гомологичный PurR^[20];
2. Сайт лактозного оперона Lac. Лактозный оперон контролируется репрессором LacI, который, связывая ДНК, препятствует транскрипции генов, ответственных за катаболизм лактозы^[6].

Регуляция трансляции

Одними из наиболее известных примеров регуляции трансляции при помощи мотив-распознающих регуляторов являются:

1. Сайт посадки рибосомы прокариот — последовательность Шайн — Дальгарно^[21], здесь связывание происходит с рибопротеином;
2. Сайт посадки рибосомы эукариот — последовательность Козак, связывание происходит с эукариотическим фактором инициации трансляции eIF1^[7];
3. IRE — регуляторные элементы, располагающиеся на 5’UTR и/или 3’UTR мРНК ферментов (к примеру, ферритина), регулирующие содержание железа в клетке. С этими мотивами связываются белки IRP1 (цитозольная форма аконитазы) и IRP2 (каталитически неактивный гомолог аконитазы), регулируя самим фактом своего связывания с мРНК скорость её деградации или скорость трансляции, происходящей с неё^[22].

Сила мотива

Сила взаимодействия белка или РНК с ДНК мотивом зависит в первую очередь от последовательности данного мотива. Различают «сильные» мотивы, дающие сильное взаимодействие с белком или РНК и «слабые» мотивы, с которыми взаимодействие слабее. Практически всегда удаётся получить так называемую «консенсусную последовательность» («консенсус»), то есть такую последовательность, в каждой позиции которой стоит буква, наиболее часто встречающаяся в соответствующей позиции в последовательностях мотивов из разных организмов. Консенсусная последовательность принимается за самую сильную, каковой она почти всегда и является^[23]. Более слабые мотивы получаются из неё с помощью небольшого (чаще всего 1—3) числа замен^[24].

Эволюция силы мотива

В процессе эволюции сила мотивов регулируется с помощью естественного отбора, причём мотив может становиться как сильнее, так и слабее^[25]. Характерным примером такой подстройки силы мотива может служить изменчивость последовательности Шайна — Дальгарно (ШД). Есть тесная корреляция между необходимым организму количеством транслируемого белка и силой ШД перед ним^[8].

В случае с ШД, хотя сила связывания белка и напрямую коррелирует с силой связывания 16S-субъединицы рибосомы, в связи с особенностями инициации трансляции, консенсусная последовательность не обязательно будет гарантировать наиболее эффективную трансляцию (из-за затруднённого ухода рибосомы с сайта инициации)^[6]. Поэтому последовательность Шайна — Дальгарно чаще всего содержит 4—5 нуклеотидов из консенсусной последовательности при длине последней примерно в 7 нуклеотидов^[26].

РНК-переключатели

Не всегда наличие мотива, явно выполняющего биологически значимую роль, влечёт за собой наличие белка-регулятора. Регуляция также может осуществляться за счёт связывания РНК с каким-либо низкомолекулярным веществом. На этом принципе построены РНК-переключатели — структуры, образующиеся на РНК во время транскрипции, способные связывать малые молекулы^[27][28]. Связывание молекулы влияет на способность рибопереключателя останавливать транскрипцию или препятствовать трансляции. В этом случае важной оказывается не последовательность нуклеотидов как таковая, а наличие комплементарных нуклеотидов на нужных местах в последовательности^[4].

Регуляция за счёт вторичной структуры

Регуляция трансляции также может осуществляться только за счёт образуемой нуклеиновой кислотой вторичной структуры.

1. Ро-независимый терминатор транскрипции — шпилька, образующаяся на синтезируемой мРНК до начала трансляции, препятствующая дальнейшему синтезу мРНК (Терминатор (ДНК))^[29];
2. IRES — сложная структура в мРНК вирусов эукариот, обеспечивающий внутреннюю инициацию трансляции^[30].

Структура мотива

Зачастую, мотивы, связывающие транскрипционные факторы, имеют вид прямых повторов некоторой последовательности, обратных повторов или палиндромных последовательностей. Это можно объяснить работой транскрипционных факторов в виде димеров белков, в которых каждый из мономеров связывает одну и ту же последовательность. Встречаются также мотивы большей повторности^[6]. Такое строение мотивов обеспечивает большую резкость реакции на изменение внешних условий. К примеру, если связывание зависит от концентрации одного вещества в клетке, то получаем зависимость силы реакции клетки, описываемую уравнением Михаэлиса — Ментен. С увеличением числа связывающихся единиц белка (будем считать, что действие связывания белка с мотивом проявляется только в случае связывания со всеми повторами) зависимость всё больше становится похожей на сигмоиду, в пределе стремясь к функции Хевисайда, описывающей один из главных принципов реагирования живых систем на многие воздействия — закон «всё или ничего» (англ. all-or-nothing law)^[6], к примеру, формирования потенциала действия^[31].

Мотивы в белках

Для белков следует различать

• мотив в последовательности аминокислот
• структурный мотив — взаимное расположение нескольких близко расположенных элементов вторичной структуры в пространстве^[2][22]. На последовательности же эти элементы могут далеко отстоять друг от друга^[32].

Мотивы в первичной структуре (последовательности белка)

Мотивы в первичной структуре похожи на мотивы в нуклеиновых кислотах. Характерными примерами таковых являются:

1. сигнальные пептиды — короткие аминокислотные последовательности в составе белка длиной порядка 3—60 аминокислот^[33], определяющие, в какой компартмент клетки будет отправлен после синтеза. Пример — сигнал ядерной локализации;
2. сайты посттрансляционной модификации белков, представляющие собой консервативные пептиды порядка 5—12 аминокислот^[6]. Пример — сайты ацетилирования в белке^[34]

Структурные мотивы

В белках структурные мотивы описывают связи между элементами вторичной структуры. Такие мотивы часто имеют участки переменной длины, которые в некоторых случаях могут и вовсе отсутствовать^[22].

1. Лейциновая молния — характерен для димерных белков, связывающих ДНК. Лейциновая молния обеспечивает контакт двух мономеров белка за счёт гидрофобных взаимодействий^[22][35]. Для него характерно наличие в каждой седьмой позиции остатка лейцина.
2. Цинковые пальцы — характерен для ДНК-связывающих факторов транскрипции^[22][36];
3. Спираль-поворот-спираль — ДНК-связывающий мотив, именно такой ДНК-связывающий фрагмент у Lac-репрессора^[22].
4. Гомеодомен — мотив, связывающий ДНК и РНК. У эукариот белки с гомеодоменами индуцируют дифференцировку клеток, запуская каскады генов, необходимых для образования тканей и органов. Похож на мотив «спираль-поворот-спираль», потому часто отдельно не выделяется^[22][37].
5. Укладка Россмана — мотив, связывающий нуклеотиды (к примеру — НАД)^[38]. Встречается, в частности, в дегидрогеназах, в том числе в глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе, участвующей в гликолизе.
6. EF-рука — мотив, связывающий ионы Са²⁺, также подобен мотиву «спираль-поворот-спираль»^[39].
7. Гнездо — три последовательных аминокислотных остатка формируют сайт связывания аниона^[40].
8. Ниша — три последовательных аминокислотных остатка формируют сайт связывания катиона^[41].
9. Бета-шпилька — два β-тяжа, соединённых коротким разворотом цепи белка^[42].

Кроме бета-шпильки выделяют и множество других мотивов, функция которых состоит в формировании структурного каркаса белка^[43].

Близким к термину структурный мотив белка является укладка — характерное расположение элементов вторичной структуры. В силу своей схожести термины часто используются один вместо другого и грань между ними размыта^[43][44].

Представление мотивов

Изначально имеется набор мотивов из разных последовательностей и ставится задача^[2]:

• представить их компактно и наглядно;
• уметь по представлению мотива осуществлять поиск его новых вхождений.

Существует несколько общепризнанных способов представления мотивов^[45]. Часть из них подходит как для белков, так и для нуклеотидов, другая часть — только для белков или нуклеотидов.

Консенсус

Строгий консенсус

Строгим консенсусом мотива назовем строчку, состоящую из самых представленных букв в множестве реализаций мотива. На практике, указывается не просто наиболее частая буква в данной позиции, но и, если максимальная частота встречаемости какой-либо буквы в данной позиции меньше заданного порога, то на этом месте в консенсусе ставится x (любая буква алфавита). По такому консенсусу мы почти наверняка находим последовательности, реально являющиеся мотивами, но упускаем большое число мотивов, отличающихся от консенсуса на несколько замен^[2][4][9]. Ниже приведён пример строгого консенсуса для участка мотива пяти взятых из UniProt белков с мотивом лейциновой молнии (порог был взят равным 80 %):

	Номер позиции
UniProt ID	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15
O35048	L	S	P	C	G	L	R	L	I	G	A	H	P	I	L
Q6XXX9	L	G	Q	D	I	C	D	L	F	I	A	L	D	V	L
Q9N298	L	G	Q	V	T	C	D	L	F	I	A	L	D	V	L
Q61247	L	S	P	L	S	V	A	L	A	L	S	H	L	A	L
B0BC06	L	T	I	G	Q	Y	S	L	Y	A	I	D	G	T	L
Консенсус	L	x	x	x	x	x	x	L	x	x	x	x	x	x	L

Нестрогий консенсус

Нестрогим консенсусом назовем последовательность списков букв, наиболее представленных на соответствующем месте. Описываются все или наиболее часто встречающиеся буквы в данной позиции (обычно устанавливается минимальный порог частоты)^[2]. Фактически, мотив описывается при помощи регулярного выражения^[4][9]. В качестве обозначений используют:

• Алфавит — совокупность отдельных символов, обозначающих определённую аминокислоту/нуклеотид или набор аминокислот/нуклеотидов;
• ABC — строка из символов алфавита, обозначающая последовательность символов, следующих друг за другом;
• [ABC] — любая строка символов, взятых из алфавита в квадратных скобках соответствует любому из соответствующих символов; например [ABC] соответствует или A или B или C;
• {ABC..DE} — любая строка символов, взятых из алфавита, соответствует любой аминокислоте, кроме тех, что находятся в фигурных скобках; например {ABC} соответствует любой аминокислоте, кроме A, B и C;
• x в нижнем регистре — любой символ алфавита.

В случае с таким представлением приходится балансировать между чувствительностью консенсуса (количеством реальных мотивов, которые им получится отыскать) и специфичностью (способностью метода отбраковывать мусорные последовательности)^[1]. Ниже приведен пример нестрого консенсуса для тех же пяти последовательностей белков, что и для строго консенсуса (порог был взят равным 20 %). Видим, что в позиции 10 мотив не совсем объективен — лейцин (L) и изолейцин (I) — очень близкие по свойствам аминокислоты, и логично было бы их обе занести в консенсус.

	Номер позиции
UniProt ID	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15
O35048	L	S	P	C	G	L	R	L	I	G	A	H	P	I	L
Q6XXX9	L	G	Q	D	I	C	D	L	F	I	A	L	D	V	L
Q9N298	L	G	Q	V	T	C	D	L	F	I	A	L	D	V	L
Q61247	L	S	P	L	S	V	A	L	A	L	S	H	L	A	L
B0BC06	L	T	I	G	Q	Y	S	L	Y	A	I	D	G	T	L
Консенсус	L	[SG]	[PQ]	x	x	C	D	L	F	I	A	[LH]	D	V	L

Prosite-консенсус (для белков)

PROSITE использует ИЮПАК для обозначения однобуквенных кодов аминокислот, за исключением символа конкатенации «-», используемого между элементами паттерна. При использовании PROSITE добавляется несколько символов, облегчающих представление белкового мотива^[46]:

• '<' — шаблон ограничивается N-концом последовательности;
• '>' — шаблон ограничивается C-концом последовательности;

Если e — шаблон элемента, и m и n два десятичных целых числа и m <= n, то:

• e(m) эквивалентно повторению e ровно m раз;
• e(m,n) эквивалентно повторению e ровно k раз для любого целого k удовлетворяющего условию: m <= k <= n;

Пример: мотив домена с сигнатурой C2H2-type цинкового пальца выглядит следующим образом: C-x(2,4)-C-x(3)-[LIVMFYWC]-x(8)-H-x(3,5)-H^[47]

Позиционная весовая матрица

Основная статья: Позиционная весовая матрица

Позиционной весовой матрицей называется такая матрица, столбцы которой соответствуют позиции в последовательности, а строчки соответствуют буквам в алфавите. Значениями этой матрицы являются частоты (или монотонные функции от частот) встречаемости данной буквы в данной позиции на последовательности. При этом обычно, чтобы исключить нулевые частоты к числу встреч каждой буквы позиции добавляют некоторое число, исходя из априорного распределения букв в подобных последовательностях^[4] (к примеру, вводят поправку Лапласа^[48]). Данный подход, как и предыдущие, неявно предполагает, что позиции в мотиве независимы, чего на самом деле не наблюдается даже для нуклеотидных последовательностей^[2][4].

Пусть у нас есть 7 последовательностей ДНК, представляющих собой мотив^[9]:

	Номер позиции
Номер последовательности	1	2	3	4	5	6	7	8
1	A	T	C	C	A	G	C	T
2	G	G	G	C	A	A	C	T
3	A	T	G	G	A	T	C	T
4	A	A	G	C	A	A	C	C
5	T	T	G	G	A	A	C	T
6	A	T	G	C	C	A	T	T
7	A	T	G	G	C	A	C	T

Позиционная матрица для них будет иметь следующий вид (+1 — учёт правила Лапласа)^[9]:

	Номер позиции
Нуклеотид	1	2	3	4	5	6	7	8
A	5 + 1	1 + 1	0 + 1	0 + 1	5 + 1	5 + 1	0 + 1	0 + 1
C	1 + 1	0 + 1	1 + 1	4 + 1	2 + 1	0 + 1	6 + 1	1 + 1
G	0 + 1	1 + 1	6 + 1	3 + 1	0 + 1	1 + 1	0 + 1	0 + 1
T	1 + 1	5 + 1	0 + 1	0 + 1	0 + 1	1 + 1	1 + 1	6 + 1

Частоты можно пронормировать на общее число последовательность, тем самым получив оценку вероятности встречи данного нуклеотида в данной последовательности (собственно, обычно в таком представлении и хранится PWM)^[2]:

	Номер позиции
Нуклеотид	1	2	3	4	5	6	7	8
A	0,55	0,18	0,09	0,09	0,55	0,55	0,09	0,09
C	0,18	0,09	0,18	0,45	0,27	0,09	0,64	0,18
G	0,09	0,18	0,64	0,36	0,09	0,18	0,09	0,09
T	0,18	0,55	0,09	0,09	0,09	0,18	0,18	0,64

HMM (скрытые марковские модели)

Скрытая марковская модель нулевого порядка для приведённых выше последовательностей одного мотива. Каждое состояние соответствует одной из позиций, вероятность перехода из одного состояния в другое равна 1. Эмиссионные вероятности для нуклеотидов изображены на состояниях

Для большей точности можно учитывать зависимость соседних позиций в мотиве с помощью скрытых марковских моделей первого и более высоких порядков^[2][4]. Этот подход сопряжён с некоторыми трудностями, так как для его применения необходимо наличие достаточно представительной выборки вариантов мотивов. В случае предыдущего примера имеем:

• Для марковской модели порядка 0 (вероятность появления нуклеотида в данной позиции от других позиций не зависит — другой способ трактовки PWM)^[4];

Скрытая марковская модель первого порядка для приведённых выше последовательностей одного мотива. Каждое состояние соответствует нуклеотиду в одной из позиций, вероятность перехода из одного состояния во другое равна вероятности появления после нуклеотида, соответствующего этому состоянию, нуклеотида, соответствующего другому

• Для марковской модели порядка 1 (вероятность появления нуклеотида в данной позиции зависит только от нуклеотида в предыдущей последовательности. Число параметров модели сильно возросло)^[4]. При расчёте вероятностей перехода также использовалось правило Лапласа. Эмисионные вероятности для состояний равны 1 для нуклеотидов, которым они соответствуют, 0 — для остальных.

В случае мотивов, содержащих участки переменного размера и нуклеотидного состава, можно было бы вводить отдельно модель для этих участков, отдельно — для консервативных, а затем «склеивать» их в одну модель путём добавления промежуточных «молчащих» состояний и вероятностей перехода в них и из них^[4].

СКС (стохастическая контекстно-свободная грамматика)

В случае мотивов, формирующих вторичные структуры (РНК-переключатели) в РНК, в элементах вторичной структуры важно учитывать возможность спаривания нуклеотидов. С этой задачей справляются СКС. Однако обучение СКС требует ещё большего размера выборки, чем HMM, и сопряжено с рядом трудностей^[4].

Представление для больших базах данных

В тех случаях, когда важна скорость поиска и допустим пропуск некоторых вхождений нашего мотива, исследователи прибегают к различным уловкам, позволяющим с приемлемой точностью зашифровать пространственную структур биополимера (РНК или белка) путём расширения алфавита^[49].

Представление мотивов в белках с помощью кодирования пространственной структуры белка

Оперон Escherichia coli репрессор лактозы LacI (PDB 1lcc chain A) и ген активатор катаболизма (PDB 3gap chain A) оба имеют мотив спираль-поворот-спираль, но их аминокислотные последовательности не очень схожи. Группой исследователей был разработан код, который они назвали «трёхмерный код цепи», представляющий структуру белка в виде строки из писем. Эта схема кодирования, по мнению авторов, показывает сходство между белками гораздо более отчётливо, чем аминокислотные последовательности^[49]:

Пример: сравнение двух упомянутых выше белков при помощи этой схемы кодирования^[49]:

PDB ID	3D-code	Amino acid sequence
1lccA	TWWWWWWWKCLKWWWWWWG	LYDVAEYAGVSYQTVSRVV
3gapA	KWWWWWWGKCFKWWWWWWW	RQEIGQIVGCSRETVGRIL
Сравнение	Видно явное сходство между белками	По аминокислотной последовательности белки сильно отличаются

где W соответствует α-спирали, и E и D соответствует β-нити.

Представление мотивов в РНК с помощью вторичной структуры (foldedBlast)

В данной работе с целью применения алгоритма поиска, схожего с BLAST, нуклеотидный алфавит (ATGC, так как поиск осуществлялся в геноме) был расширен за счёт комбинирования нуклеотидов и трех символов, характеризующих их предположительное направление спаривания^[50]:

• ( — нуклеотид спарен с нуклеотидом справа;
• ) — нуклеотид спарен с нуклеотидом слева;
• . — нуклеотид не спарен.

Таким образом получалось 12 букв нового алфавита (4 нуклеотида * 3 «направления»), при правильном использовании позволяющий осуществлять BLAST-подобный поиск, названный авторами foldedBlast^[50].

Логотип последовательностей

Основная статья: Логотип последовательностей

Мотив сайта связывания пуринового репрессора PurR из Escherichia coli. Получен с помощью пакета R seqLogo

Для визуального представления мотивов часто используют логотип последовательностей — графического представления консервативности каждой позиции в мотиве. При этом данную визуализацию можно успешно применять как и в случае представления мотива в виде консенсуса или позиционной весовой матрицы, так и для представления HMM модели последовательности, как это сделано в базе белковых семейств Pfam^[51].

Кроме того, если использовать, к примеру, яркость каждой нуклеотида в мотиве как индикатор того, насколько часто ему соответствует в этом же мотиве комплементарный нуклеотид, то можно частично представлять и информацию о вторичной структуре мотива. Так сделано, например, в биоинформатическом веб-сервисе RegPredict^[52].

Поиск сайтов связывания транскрипционных факторов in silico

Основная статья: Поиск сайтов связывания транскрипционных факторов in silico

В случае поиска в нуклеотидных последовательностях мотивов, отвечающих за связывание регуляторных белков пользуются соображением, что они [мотивы] меняются сравнительно медленно, а значит, если взять организмы, достаточно далёкие друг от друга, чтобы в высоковариабельных позициях их последовательностей успели накопиться мутации, а сайты измениться сильно ещё не успели, то можно пользоваться правилом «что консервативно — то важно»^[2]. После получения последовательностей, в которых предполагается наличия специфичного мотива, в основном используют два подхода к поиску последовательности мотива — филогенетический футпринтинг и сведение задачи к задаче поиска вставленного мотива.

Филогенетический футпринтинг

Филогенетический футпринтинг — полуавтоматический метод. Последовательности обрабатываются программой множественного выравнивания, и в получившемся выравнивании исследователем ищутся паттерны, которые можно считать мотивами. Одним из наиболее успешных примеров применения данного подхода можно считать расшифровку способа кодирования нерибосомных пептидов нерибосомными пептид-синтетазами (NRPS)^[2][53][54]. Данный метод не позволяет полностью автоматизировать процесс поиска мотивов, но при этом и не имеет столь сильных ограничений, как следующие.

Задача поиска вставленного мотива

В случае с мотивами без (почти без) разрывов и без (почти без) участков переменной длины возможно свести задачу поиска мотива к задаче поиска вставленного мотива (англ. Planted motif search)^[2][9].

Формулировка задачи следующая: «На вход предоставлены n строк s₁, s₂, …, s_n длины m, каждая составленная из символов алфавита A, и два числа — l и d. Найдите все строки x длины l такие, что любая из предоставленных строки содержит хотя бы одну подпоследовательность, находящуюся от x на расстоянии Хэмминга не больше d»^[55].

Так как в общем случае неизвестно, все ли полученные нами последовательности имеют искомый мотив, а также неизвестна его точная длина, то обычно задачу решают эвристическими методами — максимизируя вероятность найденного мотива при данных последовательностях. На этом принципе построены программы MEME^[17] и GibbsSampler^[56].

Если задать минимальный порог на число последовательностей, в которых должен содержаться мотив, и как-либо ограничить его длину, то можно использовать и точные способы решения данной задачи, к примеру — алгоритм RISOTTO^[57]. Некоторые из них позволяют снимать часть ограничений на искомый мотив — в RISOTTO искомый мотив может иметь разрывы, состоять из нескольких частей.

Однако эти методы редко дают результаты лучше, чем MEME и GibbsSamler, а работают они значительно дольше^[2][58].

Поиск сайтов связывания in vitro

ChIP-seq

Основная статья: ChIP-seq

Метод анализа ДНК-белковых взаимодействий, комбинирующий идеи иммунопреципитации хроматина (ChIP) и высокоэффективном секвенировании ДНК (белок пришивается к ДНК, затем кусочки ДНК, пришившиеся к белку отправляются на секвенирование). В ходе работы метода получаются участки длиной около 150 нуклеотидов, которые затем можно анализировать in silico на наличие мотива^[59].

ChIP-on-chip

Как и в случае использования метода ChIP-seq проводится иммунопреципитации хроматина (ChIP), затем сшивка с белком обращается и полученная ДНК гибридизуется с ДНК-микрочипом. Метод ChIP-on-chip дешевле, чем ChIP-seq, однако сильно уступает последнему в точности^[6].

ChIP-exo

Также метод, основанный на иммунопреципитации хроматина (ChIP). Использование экзонуклеазы фага λ, деградирующей ДНК только с 5'-конца и только в случае отсутствия контакта с белком, позволяет добиваться точности порядка нескольких нуклеотидов в определении положения сайта связывания белка^[60].

SELEX

Основная статья: SELEX

Итеративный метод поиска нуклеотидных последовательностей, хорошо связывающихся с данным белком^[61]. Процедура в общем случае выглядит так:

1. Интересующий нас белок пришивается к колонке, через которую далее пропускается раствор с набором последовательностей, состоящих из рандомизированного участка и адаптера;
2. Последовательности, задержавшиеся на колонке клонируют процедуре ПЦР, причем состав реакционной смеси подобран таким образом, чтобы вносить дополнительные ошибки при копировании. Полученные клоны отправляются на новый раунд SELEX;
3. Через каждые несколько участков условия (pH раствора, его ионная сила) ужесточаются, чтобы на колонке оставались все более и более специфичные к белку последовательности;
4. Получающиеся на выходе последовательности часто похожи на реальные мотивы связывания белка в живых организмах.

DamID

Делается гибридный белок из изучаемого белка и адениновой ДНК-метилтрансферазы Dam^[62]. В естественных условиях аденин в большинстве эукариот не метилируется. Когда же гибридный белок связывается с каким-либо сайтом в ДНК организма, метилтрансферазная часть модифицирует аденины в районе этого сайта, что позволяет затем с помощью эндонуклеаз рестрикции выделить участок, на котором с большой долей вероятности находится искомый мотив.