RAF1

RAF1 («RAF прото-онкогенная серин/треониновая протеинкиназа»; англ. RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase; КФ:2.7.11.25), или c-RAF («прото-онкоген c-RAF»; англ. proto-oncogene c-RAF) — цитозольная серин/треониновая протеинкиназа семейства MAP3K^{[англ.][1]}. Продукт гена RAF1^[2][3]. Является частью сигнального пути ERK1/2 в качестве митоген-активируемой протеинкиназы MAP3K, которая действует ниже по каскаду семейства мембрано-связанных ГТФаз Ras^[4]. Raf1 — член семейства серин/треониновых протеинкиназ Raf.

RAF1
Идентификаторы
Псевдонимы	v-raf-1 murine leukemia viral oncogene-like protein 1cRafC-Raf proto-oncogeneserine/threonine kinasev-raf-1 murine leukemia viral oncogene homolog 1raf proto-oncogene serine/threonine protein kinaseproto-oncogene c-RAFRAF1Raf-1Oncogene RAF1RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinaseProto-Oncogene Proteins c-rafProto-Oncogene Protein c-raf
Внешние ID	GeneCards:
Паттерн экспрессии РНК Bgee Человек Мышь (ортолог) н/д н/д BioGPS Дополнительные справочные данные
Ортологи Вид Человек Мышь Entrez н/д н/д Ensembl н/д н/д UniProt н/д н/д RefSeq (мРНК) н/д н/д RefSeq (белок) н/д н/д Локус (UCSC) н/д н/д Поиск по PubMed н/д н/д
Информация в Викиданных
Смотреть (человек)

Открытие

Первый ген Raf, а именно v-Raf был открыт в 1983 году. Он был выделен из ретровируса мыши 3611. Вскоре было показано, что этот белок способен трансформировать фибробласты в раковую клеточную линию, поэтому ему було дано название вирус-индуцированная быстро распространяющаяся фибросаркома, или v-Raf (Virus-induced Rapidly Accelerated Fibrosarcoma; V-RAF)^[2]. Через год в 1984 году другой трансформирующий ген был обнаружен в птичьем ретровирусе MH2 и назван v-Mil. Он оказался крайне похож на v-Raf^[5]. Оказалось, что оба открытых гена кодируют продукт с серин-треониновой киназной активностью^[6]. Гомологи v-Raf и v-Mil были вскоре найдены в геномах мыши и курицы, которые были названы c-Raf от клеточный (cellular) ген Raf. Стало ясно, что c-Raf играет роль в регуляции роста и деления клетки^[7][8]. Теперь известно, что c-Raf является основой сигнального пути ERK1/2, первого описанного сигнального пути митоген-активируемых киназ MAPK^[9]. Он действует как митоген-активируемая киназа, инициирующая весь последующий киназный каскад. Нормальные клеточные гены c-Raf могут мутировать и превращаться в онкогены за счёт повышения активностей MEK1/2 and ERK1/2^[10].

Структура

Ген RAF1 человека расположен на 3-й хромосоме. Альтернативный сплайсинг приводит к образованию двух изоформ белка с лишь небольшой разницей между вариантами. Основной вариант протеинкиназы короче и состоит из 648 аминокислот^[11].

Структура белка c-Raf человека

Подобно многим другим MAP3K протеинкиназам c-Raf является мультидоменным белком с несколькими дополнительными доменами, которые отвечают за регуляцию его каталитической активности. На N-конце белка рядом друг с другом находятся Ras-связывающий домен (RBD) и гомолог C-киназного домена 1 (C1). Структура обоих доменов была изучена и показала механизм регуляции c-Raf.

Ras-связывающий домен содержит убиквитин-подобный участок подобно многим другим домена, связывающим G-белки. Он специфически связывает только ГТФ-ассоциированные Ras белки^[12][13][14].

Домен C1 белка c-Raf расположен сразу за RBD и представляет собой цинковый палец, обогащённый цистеинами и стабилизированный 2 ионами цинка. Он похож на диацилглицерин-связывающие домены C1 белков семейства протеинкиназ C (PKC)^[15][16]. Однако, в отличие от PKC, домен C1 в c-Raf не связывает диацилглицерин^[17]. Они связывают другие липиды, такие как церамид^[17] или фосфатидная кислота^[18] и, более того, облегчают распознавание активированного ГТФ-связанного Ras (ГТФ-Ras)^[16][19].

Близкая расположенность двух регулайторных доменов и экспериментальные данные предполагают, что они действуют координированно как единый элемент, который отрицательно регулирует активность киназного домена c-Raf за счёт физического взаимодействия^[20]. Исторически аутоингибирующий блок обозначают как регион CR1, соединяющий участок — CR2, а киназный домен — CR3.

Между аутоингибирующим доменом и каталитичеким киназным доменом расположен продолжительный сегмент, обогащённый серином, аминокислотная последовательность которого сильно варьирует между генами Raf. Этот регион внутренне неструктурированный и очень подвижный. По всей видимости, он служит «шарниром» между двумя жёсткими струкрутными доменами, который позволяет осуществлять существенные конформационные перестройки внутри молекулы киназы^[21]. Тем не менее, этот шарнирный регион содержит один небольшой консервативный мотив, который отвечает за распознавание регуляторного белка 14-3-3, когда критический для этого процесса остаток серина (у человека серин-259) в молекуле c-Raf фосфорилирован. Кроме этого, второй похожий мотив в c-Raf находится на C-конце за киназным доменом.

C-концевую половину c-Raf занимает каталитический домен. Структура этих доменов хорошо изучена как в c-Raf^[22], так и в B-Raf^[23]. Киназный домен c-Raf похож на таковой других киназ Raf и белков KSR и напоминает каталитический домен некоторых других MAP3K киназ, включая семейство киназ MLK. Вместе эти ферменты составляют группу киназ TKL (тирозинкиназо-подобные белки). Хотя эти белки обладают некоторыми характеристиками тирозинкиназ, активность белков TKL ограничена фосфорилированием серина и треонина только определённых белков-мишеней. Наиболее важные субстраты киназ Raf — киназы MKK1 и MKK2, активность которых строго регулируется этим фосфорилированием, осуществляемым белками Raf.

Эволюция киназ Raf

Основная статья: Киназы Raf

Белок c-Raf человека входит в семейство родственных протеинкиназ. Два других члена группы, обнаруженных у большинства позвоночных — B-Raf и A-Raf. Все три белка сходны своей доемнной архитектурой, структурой и регуляцией. В отличие от хорошо изученных c-Raf и B-Raf точные функции другого члена группы A-Raf не извеестны, хотя предполагается, что они должны быть сходными. Все три гена группы, по-видимому, являются продуктами дубликации гена-предшественника Raf или целого генома на заре эволюции позвоночных. Большинство других организмов имеют единственный ген Raf. Например, у фруктовой мушки дрозофилы это ген Phl, или Draf^[24], а у C. elegans — ген Lin-45^[25].

Семейство киназ Raf. Сравнительная структура.

Многоклеточные организмы имеют тип киназы близкородственный с Raf — киназный супрессор Ras (KSR). У позвоночных животных два паралога гена KSR: KSR1^[англ.] и KSR2^[англ.]. Их C-концевой киназный домен похож на таковой у Raf, однако регуляторный N-терминальный домен у них отличается. Хотя у KSR тоже есть шарнирный регион, у него отсутствует Ras-связывающий домен. Вместо последнего расположен уникальный регуляторный домен CA1. Структура была раскрыта в 2012 году и содержит домен SAM-мотив с добавочной двуспиральной областью (coiled coil), т. н. CC-SAM, который помогает белкам KSR при мембранном связывании^[26]. KSR, так же, как и Raf, содержат двойной мотив связывания с белками 14-3-3, требующий фосфорилирования, но, кроме этого, они содержат на шарнирном участке другие MAPK-связывающие мотивы. Типичная последовательность последних, -FxFP-, играет важную роль в регуляции Raf-киназ в сигнальных путях ERK1/2. KSR участвуют в тех же сигнальных путях, что и киназы Raf, но играют пти этом второстепенную роль. Их внутренняя киназная активность настолько низкая, что долгое время они считались неактивными^[27][28]. Их роль в фосфорилировании несущественна и, по-видимому, в основном KSR являются партнёрами в гетеродимеризации с киназами Raf, значительно активируя их за счёт аллостерического эффекта. Подобные эффекты были описаны и для других MAP3K киназ. Например, ASK2 обладает низкой ферментативной активностью сам по себе и его действие связано с образованием гетеродимера ASK1/ASK2^[29].

Raf-подобные киназы полностью отсутствуют у грибов. Однако у других заднежгутиковых (в частности, у Capsaspora owczarzaki) были обнаружены гены Raf-киназ, что подтверждает наличие их у одноклеточных эукариот. Это говорит о том, что белки Raf имеют древнюю эволюционную историю и грибы, возможно, потеряли ген Raf позже. У грибов сигнальные пути аналогичные ERK1/2 обеспечиваются другими MEKK-подобными киназами (Ste11 у дрожжей).

Наоборот, вирусные Raf киназы (v-Raf) являются вторичным заимствованием генов позвоночных у их организмов-хозяинов. Эти гены являются значительно укороченными версиями, у которых отсутствуют аутоингибирующий N-концевой домен и 14-3-3-связывающие мотивы, что приводит к некотролируемой активности вирусной Raf киназы, что и необходимо вирусу для эффективной репродукции.

Регуляция активности

Схема «закрытой» формы c-Raf, усиленная ассоциацией с димерами регуляторного белка 14-3-3, связанными с фосфорилированными мотивами «шарнирного» региона киназы^[30][31].

Активность c-Raf строго регулируется. Как главный пусковой механизм сигнального пути ERK1/2 — активация c-Raf — предохраняется множеством ингибирующих механизмов и в норме белок не может быть активирован в результате лишь одного-единственного шага. Наиболее важный регуляторный механизм — прямое физическое взаимодействие N-терминального аутоингибирующего блока c-Raf с его киназным доменом. В результате этого каталитический сайт белка оказывается физически закрыт и ферментативная активность киназы — полностью заблокирована^[20]. Такая «закрытая» форма может быть изменена только, если аутоингибирующий блок белка взаимодействует с белком-партнёром, конкурирующим с собственным киназным доменом, главным образом с ГТФ-связанным Ras. Такие активированные G-белки могут разорвать внутримолекулярное взаимодействие, что в результате изменяет конформацию c-Raf и переводит его в «открытую» форму^[32] необходимую для киназной активации и связывания субстрата.

Белок 14-3-3 также вносит вклад в аутоингибирование c-Raf. Известно, что белки 14-3-3 образуют димеры и, таким образом, имеют два связывающих участка^[33]. За счёт этого димер 14-3-3 действует как «молекулярный замок», удерживая потенциально связывающие белки-партнёры на безопасном расстоянии и ориентации от c-Raf. Таким образом, димер 14-3-3 (в частности 14-3-3ζ), будучи вовлечён во взаимодействие с c-Raf, запирает киназу в «закрытом» состоянии и не позволяет разделение аутоингибирующего и каталитического доменов белка^[34]. Такое «запирание» c-Raf, как и других представителей Raf и KSR, контролируется фосфорилированием 14-3-3-связывающего мотива на «шарнирном» участке белка. Оно невозможно без предварительного фосфорилирования определённых серинов (у c-Raf человека — это серины 259 и 621) другими протеинкиназами. Наиболее важной из этих киназ является MAP3K7/TAK1, а ферменты, отвечающие за дефосфорилирование этих аминокислот — фасфатаза PP1 и фосфатазный комплекс PP2A^[35][36].

Само по себе связывание 14-3-3 с Raf не обязательно является ингибирующим фактором. Когда Raf находится в открытой форме и образует димер 14-3-3 может связаться с Raf в транс-конфигурации и, таким образом замкнуть киназу в её димерной форме вместо предотвращения этого взаимодействия, отделяя их друг от друга^[37]. Существуют также некоторые другие формы взаимодействия 14-3-3 с Raf, однако их роль неизвестна^[38].

Димеризация c-Raf является другим важным механизмом регуляции активности киназы и требует фосфорилирования активационной петли белка. В норме только открытые киназные домены участвуют в димеризации. В отличие от B-Raf, который образует гомодимер, c-Raf предпочтительно формирует гетеродимер с B-Raf или KSR1. Тем не менее гомо- и гетеродимеры функционируют сходным образом^[28].

Для достижения полной активности и стабилизации активной конформации необходимым этапом является фосфорилирование активационной петли c-Raf. Единственными известными киназами, которые способны это сделать — сами киназы семейства Raf. Хотя некоторые другие киназы, такие как PAK1, способны фосфорилировать аминокислотные остатки, расположенные вблизи киназного домена c-Raf, роль этих поддерживающих неизвестна. Активационная петля c-Raf может быть трансфосфорилирована либо другой молекулой c-Raf, либо KSR1. По причине структурных особенностей димеров такое фосфорилирование может осуществляться исключительно в транс-конфигурации (то есть киназы одного димера могут фосфорилировать только остатки другого димера при образовании промежуточного четырёхмолекулярного комплекса)^[39]. После взаимодействия с остатками аргинина и лизина киназного домена фосфорилированная активирующая петля меняет конформацию на строгоупорядоченную форму и замыкает киназный домен в полностью активированной форме вплоть до дефосфорилирования петли. При этом киназный домен становится нечувствительным к аутоингибирующему домену^[40]. У KSR отсутствуют участки фосфорилирования в активирующей петле, поэтому у этих белков отсутствует последний этап активации, однако это уже несущественно, поскольку активированная киназа Raf уже способна распознавать свой субстрат^[41]. Как и большинство протеинкиназ c-Raf имеет несколько возможных субстратов. c-Raf напрямую фосфорилирует BAD^[42], несколько типов аденилатциклаз^[43], фосфатазу лёгких цепей миозина (MYPT)^[44], тропонин (TnTc)^[45] и некоторые другие, включая белок ретинобластомы (pRb) и фосфатаза Cdc25^[46].

Наиболее важные мишени киназы Raf — MKK1(MEK1) и MKK2(MEK2). Несмотря на то, что структура фермент-субстратного комплекса c-Raf:MKK1 неизвестна, он может быть моделирован комплексом KSR2:MKK1^[28]. Хотя сам комплекс KSR2:MKK1 неактивен, считается, что он очень близок к тому как Raf связывает субстрат. Основная взаимодействующая интерфаза формируется C-концевыми регионами обоих киназных доменов. Большая неупорядоченная пролин-обогащённая петля, уникальная для MKK1 и MKK2, также играер важую роль в правильном ориентировании Raf (или KSR)^[47]. В результате реакции после связывания с Raf MKK1 или MKK2 фосфорилируются в двух положениях в своей активирующей петле и переходят сами в активную форму. Мишенями этих киназ MKK1 или MKK2 в последующем киназном каскаде являются ERK1 и ERK2, соответственно. Киназы ERK способны воздействовать на многочисленные субстраты в клетке. Кроме этого, после транслокации в ядро они способны стимулировать ядерные факторы транскрипции. Активированные ERK — плейотропные эффекторы клеточной физиологии и играют важную роль в контроле экспресси генов, вовлечённых в клеточное деление, миграцию, ингибирование апоптоза и дифференцировку.

Патология

Мутации с повышенной активностью

Наследственные мутации с повышенной активностью c-Raf встречаются довольно редко, но приводят к серьёзным синдромам. Чаще всего такие нарушения вызываются точечными мутациями в одном из двух участков связывания 14-3-3^[48][49]. Мутации c-Raf — одна из причин синдрома Нунан, характерные черты которого: врождённые пороки сердца, низкорослость, дисморфизм и др. нарушения. Похожие нарушения могут также вызывать т. н. синдром LEOPARD с комплексом дефектов.

Роль в онкологических заболеваниях

Хотя c-Raf может мутировать в экспериментальных условиях и изредка встречается в опухолях человека^[50][51], основную роль в онкогенезе человека играет киназа B-Raf^[52].

Около 20 % опухолей человека содержат мутированный ген B-Raf^[53]. Наиболее часто встречается мутация, включающая замену валина-600 на глутаминовую кислоту, продукт которой (BRAF-V600E) может быть визуализован с помощью гистохимического анализа для молекулярной клинической диагностики^[54][55]. Это изменение структурно сходно с фосфорилированной формой активирующей петли белка и, снимая один из ингибирующих механизмов, приводит к быстрой полной активации киназы^[56]. Поскольку B-Raf способна активироваться при образовании гомодимера или гетеродимера с c-Raf, подобная мутация приводит к катастрофическим последствиям, делая сигнальный путь ERK1/2 постоянно активным и приводя к неконтролируемому процессу клеточного деления^[57].

Терапевтическай мишень

Важная роль мутаций генов Ras и B-Raf в онкогенезе объясняет их роль как потенциальных мишеней для противораковой терапии, в частности, такой мишенью является мутация B-Raf V600E. Специфический ингибитор Сорафениб стал первым таким клинически полезным агентом, который стал фармакологической альтернативой для лечения ранее, как правило, неизлечимых онкологических опухолей, таких как почечная клеточная карцинома и меланома^[58]. Другие такие агенты включают Вемурафениб, Регорафениб, Dabrafenib и др.

Однако эти ингибиторы B-Raf могут иметь неблагоприятный эффект на K-Ras-зависимые опухоли, поскольку являются слишком селективными, действуя только на B-Raf. Они эффективно инибируют активность B-Raf в случае, когда мутация B-Raf является главной причиной возникновения опухоли. Но они также усиливают гомодимеризацию B-Raf и его гетеродимеризацию с c-Raf, что в результате повышает активирование c-Raf в случае, если в генах Raf нет мутаций, но есть мутация в гене их активатора K-Ras^[22]. Такая парадоксальная активация вызывает необходимость предварительной генетической диагностики до начала терапии с инибиторами B-Raf^[59].

Взаимодействия

C-Raf взаимодействует с многочисленными клеточными белками, включая следующие:

• AKT1^[60],
• ASK1^[61],
• BAG1^[62],
• BRAF^[63],
• Bcl-2^[64],
• CDC25A^{[англ.][65][66]},
• CFLAR^{[англ.][67]},
• FYN^[68],
• GRB10^[69][70],
• HRAS^{[71][72][73][74][75][76][77][78][79][80][81][82][83][84][85][86][87]},
• HSP90AA1^[88][89],
• KRAS^[76][77],
• MAP2K1^[90],
• MAP3K1^[91],
• MAPK7^[92],
• MAPK8IP3^[93][94],
• PAK1^[95],
• PEBP1^[90],
• PHB^[96],
• PRKCZ^[97],
• RAP1A^{[12][81][98][99]},
• RHEB^{[100][101][102]},
• RRAS2^[76][103],
• RB1^[96][104],
• RBL2^[104],
• SHOC2^[76],
• STUB1^[88],
• Src^[68],
• TSC22D3^[105],
• YWHAB^{[75][97][106][107][108][109]},
• YWHAE^[108][109],
• YWHAG^{[97][110][111]},
• YWHAH^{[97][108][112]},
• YWHAQ^{[90][97][110][113]},
• YWHAZ^{[97][114][115][116][117]}.

Литература

• Reed J. C., Zha H., Aime-Sempe C., Takayama S., Wang H. G. Structure-function analysis of Bcl-2 family proteins. Regulators of programmed cell death (англ.) // Advances in Experimental Medicine and Biology^[англ.] : journal. — Springer Nature, 1997. — Vol. 406. — P. 99—112. — doi:10.1007/978-1-4899-0274-0_10. — PMID 8910675.
• Geyer M., Fackler O. T., Peterlin B. M. Structure–function relationships in HIV-1 Nef (англ.) // EMBO Rep.^[англ.] : journal. — 2001. — Vol. 2, no. 7. — P. 580—585. — doi:10.1093/embo-reports/kve141. — PMID 11463741. — PMC 1083955.
• Dhillon A. S., Kolch W. Untying the regulation of the Raf-1 kinase (англ.) // Archives of Biochemistry and Biophysics^[англ.] : journal. — Elsevier, 2002. — Vol. 404, no. 1. — P. 3—9. — doi:10.1016/S0003-9861(02)00244-8. — PMID 12127063.
• Greenway A. L., Holloway G., McPhee D. A., Ellis P., Cornall A., Lidman M. HIV-1 Nef control of cell signalling molecules: multiple strategies to promote virus replication (англ.) // J. Biosci.^[англ.] : journal. — 2004. — Vol. 28, no. 3. — P. 323—335. — doi:10.1007/BF02970151. — PMID 12734410.
• Chen H., Kunnimalaiyaan M., Van Gompel J. J. Medullary thyroid cancer: the functions of raf-1 and human achaete-scute homologue-1 (англ.) // Thyroid : journal. — 2006. — Vol. 15, no. 6. — P. 511—521. — doi:10.1089/thy.2005.15.511. — PMID 16029117.