STED-микроскопия

STED-микроскопия (англ. Stimulated Emission Depletion Microscopy — микроскопия на основе подавления спонтанного испускания) — разновидность флюоресцентной микроскопии, достигающая разрешения сверх дифракционного предела путём избирательного тушения флюоресценции^[1]. Метод был разработан Штефаном Хеллем в 1994 году^[2] и продемонстрирован в 1999 году. Удостоен Нобелевской премии по Химии в 2014 г.^[3]

В 1986 г. В. А. Охонин (Институт Биофизики CO АН СССР) запатентовал идею STED-микроскопа^[4]. Этот патент был, по-видимому, неизвестен Хеллю и Вихману в 1994.

Принцип метода

Накачка (1) переводит систему в возбуждённое состояние. Флуоресценция (2) подавляется конкурирующим стимулированным испусканием (3)

При обычной конфокальной люминесцентной микроскопии исследуемое вещество оптически возбуждается, и его флюоресценция регистрируется приёмником. Пространственное разрешение метода ограничено дифракционным пределом порядка

${\displaystyle D={\frac {\lambda }{NA}},}$

где ${\displaystyle \lambda }$ — длина волны, а ${\displaystyle NA}$ — апертура.

Для его преодоления в STED-микроскопии используется второй лазер с бо́льшей длиной волны для стимулирования излучательных переходов в веществе по краям фокусного пятна. При облучении кольцевым лазером происходит принудительное испускание перехода с возбуждённого уровня на некоторый вибрационный уровень. Таким образом, на краях пятна происходит обеднение населённости возбуждённого уровня, и люминесценция на длине волны ${\displaystyle \lambda }$ подавляется, позволяя достичь лучшего разрешения в центральной области.

Сравнение обычной конфокальной микроскопии (слева), и STED-микроскопии (центр) на примере репликативных фабрик ДНК. Справа показано наложение двух методов. Черно-белые врезки ниже иллюстрируют, что разрешение STED-микроскопии выше.

Пятно основного возбуждения (слева), кольцевое пятно стимулированного излучения (центр), область флюоресцирующего вещества (справа).