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DAPI

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DAPI
IUPAC名
2-(4-Amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine
别名 4',6-Diamidino-2-phenylindole
识别
CAS号 28718-90-3  ✓
PubChem 2954
ChemSpider 2848
SMILES
InChI
InChIKey FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYAH
ChEBI 51231
性质
化学式 C16H15N5
摩尔质量 277.32 g·mol−1
若非注明,所有数据均出自一般条件(25 ℃,100 kPa)下。

DAPI4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole),是一种能够与DNA强力结合的荧光染料,常用于荧光显微镜观测[1]。因为DAPI可以透过完整的细胞膜[2],它可以用于活细胞和固定细胞的染色

历史

1971年DAPI在一项关于制抗锥虫病英语Trypanosomiasis的药物的研究中由Otto Dann的实验室首次合成,虽然它不是一种成功的药物,但更深入的研究表明它在与DNA强力结合时发出更强的荧光,因此在1975年它被用在超速离心分析法中以标记线粒体DNA。与DNA结合时激发的强荧光使它被广泛用于荧光显微镜技术中对DNA的染色。上世纪70年代末证实DAPI可以被用来在植物微生物多细胞动物细菌[3]细胞中追踪DNA,1977年证实它可以被用来定量给细胞中的DNA染色,同时也证实DAPI可在流式细胞术中用作DNA染料。[4]

荧光属性

发射与吸收波长

荧光显微镜观察下,与双股DNA结合的DAPI染剂在358 nm(紫外线)处有一个最大吸收峰,并在461 nm(蓝)处有一个最大发射峰,其发射光的波长范围含盖了蓝色至青绿色,因此在荧光显微技术中DAPI被紫外线照亮且被蓝或青色滤镜检出。DAPI也可以和RNA结合,但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果,其发射光的波长范围约在400 nm左右。[5][6][7]

DAPI的发射光为蓝色,且DAPI和荧光素绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)或Texas Red染剂(红色荧光染剂)的发射波长,仅有少部分重叠,研究员可以善用这项特性在单一的样品上进行多重荧光染色。如果需要十分精确的分析,可以使用光谱去混合(spectral unmixing)技术计算此一影响。

DAPI 结合于DNA小沟(蓝和绿). From PDB 1D30.
DAPI 结合于DNA小沟(蓝和绿). From PDB 1D30.

吸收模型

2013年,有研究者以含时密度泛函理论英语Time-dependent density functional theory等电位聚焦连续极化介质模型英语Polarizable continuum model描述了DAPI与DNA结合与发出荧光的机制,此一量子力学模型解释了DAPI与DNA结合后吸收与发射光谱的现象,与DNA的结合会使DAPI分子因位向限制导致几何弹性降低,且周围围环境的极性甚低会导致DAPI分子的极性降低。[8]

用途

除了用于分析荧光显微法以外,DAPI也经常在细胞培养中被用于追踪侵染的支原体病毒。在培养基上培养的支原体病毒颗粒被DAPI染色后会发出荧光而易于追踪。[9]

DAPI也经常在流式细胞术中用于区分不同细胞周期时相的细胞。[10][11]

活细胞安全性

毒性

DAPI可用于固定细胞染色,但是因为活细胞染色对DAPI浓度有严格要求,它很少被用于活细胞染色。[12]虽然DAPI能快速进入活细胞中与DNA结合[2],但是MSDS[13]和其他文献[2]认为DAPI没有毒性。

有研究表明,大剂量的DAPI可以导致小鼠中毒死亡,LD50= 基质 37.3 mg/kg。[14]

潜在的诱变性

DAPI被视为一种致癌物。尽管DAPI没有显现出对大肠杆菌的诱变性[15],在机器制造商提供的信息上,DAPI被认为是一种DNA诱变剂[7]。由于DAPI可以掺入DNA螺旋中,它很可能具有底层的DNA诱变性,在使用过程中应注意配制、使用与抛弃的处理程序。

替代

以DAPI(蓝)与鬼笔环肽(红)染色的内皮细胞,另外绿色为与使用与异硫氰酸荧光素(英语:fluorescein isothiocyanate)结合的抗体进行免疫荧光法(英语:Immunofluorescence)的结果
以DAPI(蓝)与鬼笔环肽(红)染色的内皮细胞,另外绿色为与使用与异硫氰酸荧光素英语fluorescein isothiocyanate结合的抗体进行免疫荧光法英语Immunofluorescence的结果

类似于DAPI技术,赫斯特染色是一种既可以用于活细胞也可以用于固定细胞的蓝色荧光染料[16],并且可以使用与DAPI相同的机器滤镜设置。

参见

参考资料

  1. ^ 4',6-二脒基-2-苯基吲哚. 来邦网. [2010-01-21]. 
  2. ^ 2.0 2.1 2.2 徐锦堂; 王黎; 周清; 杨艳; 陈剑. CM_Dil与DAPI联合标记人羊膜上皮细胞的可行性研究_王黎.pdf. 2013. doi:10.13389/j.cnki.rao.2013.11.001. 
  3. ^ M Cassan; E Boy; F Borne. Regulation of the lysine biosynthetic pathway in Escherichia coli K-12: isolation of a cis-dominant constitutive mutant for AK III synthesis.. J Bacteriol. 1975 Aug. PMID 238953. 
  4. ^ Kapuscinski J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotech Histochem. September 1995, 70 (5): 220–33. PMID 8580206. doi:10.3109/10520299509108199. 
  5. ^ Scott Prahl, DAPI. accessed 2009-12-08.
  6. ^ Kapuscinski J., [1]. accessed 2013-02-25.
  7. ^ 7.0 7.1 Invitrogen, DAPI Nucleic Acid Stain 互联网档案馆存档,存档日期2009-03-06.. accessed 2009-12-08.
  8. ^ A. Biancardi; T. Biver; F. Secco; B. Mennucci. An investigation of the photophysical properties of minor groove bound and intercalated DAPI through quantum-mechanical and spectroscopic tools.. Phys. Chem. Chem. Phys. 2013, 15: 4596. Bibcode:2013PCCP...15.4596B. doi:10.1039/C3CP44058C. 
  9. ^ RUSSELL, W. C.; NEWMAN, CAROL; WILLIAMSON, D. H. A simple cytochemical technique for demonstration of DNA in cells infected with mycoplasmas and viruses. Nature. 1975, 253 (5491): 461–462. Bibcode:1975Natur.253..461R. doi:10.1038/253461a0. 
  10. ^ Ashraf M. Khalil. B Cell Signal Transduction in Germinal Center B Cells is Short-Circuited by Increased Phosphatase Activity. Science. 2012 Jun 1 [2019-05-11]. 
  11. ^ Kerenyi, Marc A; Shao, Zhen; Hsu, Yu-Jung; Guo, Guoji; Luc, Sidinh; O'Brien, Kassandra; Fujiwara, Yuko; Peng, Cong; Nguyen, Minh; Orkin, Stuart H. Histone demethylase Lsd1 represses hematopoietic stem and progenitor cell signatures during blood cell maturation. eLife. 2013-06-18, 2 (2013; 2) [2019-05-11]. PMID 23795291. doi:10.7554/eLife.00633. 
  12. ^ Zink D, Sadoni N, Stelzer E. Visualizing Chromatin and Chromosomes in Living Cells. Usually for the live cells staining Hoechst Staining is used. DAPI gives a higher signal in the fixed cells compare to Hoechst Stain but in the live cells Hoechst Stain is used.. Methods. 2003, 29 (1): 42–50. PMID 12543070. doi:10.1016/S1046-2023(02)00289-X. 
  13. ^ http://www.kpl.com/docs/msds/710301.pdf
  14. ^ Slieger RF; 等. DAPI对鼠疟的治疗作用.pdf. 1980. doi:10.13389/j.cnki.rao.2013.11.001. 
  15. ^ Ohta T, Tokishita S, Yamagata H. Ethidium bromide and SYBR Green I enhance the genotoxicity of UV-irradiation and chemical mutagens in E. coli.. Mutat. Res. 2001, 492 (1–2): 91–7. PMID 11377248. doi:10.1016/S1383-5718(01)00155-3. 
  16. ^ Latt, SA; Stetten, G; Juergens, LA; Willard, HF; Scher, CD. Recent developments in the detection of deoxyribonucleic acid synthesis by 33258 Hoechst fluorescence.. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. July 1975, 23 (7): 493–505. PMID 1095650. doi:10.1177/23.7.1095650. 
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