Hromatografija

Hromatografija (od grč. χρώμα:chroma, boja i γραφειν:grafein pisati) je zbirni naziv za grupu laboratorijskih tehnika za razdvajanje smjesa. Ona uključuje kretanje ispitivane smjese, rastvorene u "mobilnoj fazi", kroz "stacionarnu fazu", čime se dijelovi smjese razdvajaju i izoliraju, te ih je moguće analizirati i kvantitativno odrediti. Hromatografija može biti analitička i preparativna. Preparativna hromatografija se bavi razdvajanjem komponenti iz smjese radi dalje obrade, te se može smatrati metodom prečišćavanja. U analitičkoj hromatografiji se obično radi sa malim uzorcima te se pokušava izmjeriti relativni omjer komponenti u smjesi. Hromatografija je jedna od vodećih analitičkih metoda i omogućava razdvajanje i kvantitativno određivanje supstanci veoma slične strukture i hemijskih osobina. Pod hromatografijom se podrazumijevaju metode razdvajanja koje se zasnivaju na različitoj raspodjeli komponenata uzorka između dvije faze, od kojih je jedna nepokretna (stacionarna), a druga pokretna (mobilna) u odnosu na prvu.^[1]

Ploča razvijena tankoslojnom hromatografijom

Historija

Prvu hromatografsku tehniku je pronašao ruski botaničar Mihail Cvet 1900. godine tokom svog istraživanja hlorofila. Koristio je staklenu kolonu koja je sadržavala kalcij karbonat da bi razdvojio biljne pigmente. Ovu metodu je opisao 30. decembra 1901. godine na 11. Kongresu naturalista i doktora (rus. "XI съезд естествоиспытателей и врачей") u Sankt Petersburgu. Zanimljivo je da Mikhailovo prezime "Tsvet" na ruskom jeziku znači boja, tako da je moguće da je hromatografiju nazvao po svom prezimenu. Godine 1952. britanski naučnici Archer John Porter Martin i Richard Laurence Millington Synge su dobili Nobelovu nagradu za hemiju za svoje otkriće particione hromatografije. Od tada, hromatografija se brzo razvija. Naučnici su ubrzo otkrili da se principi Tsvetove hromatografije mogu primijeniti na različite načine i varijante. U isto vrijeme, poboljšane su i unaprijeđene tehničke performanse hromatografije, omogućavajući razdvajanje veoma sličnih molekula.

Pojmovi u hromatografiji

• Analit je supstanca koja se razdvaja u hromatografiji.
• Analitička hromatografija se koristi za određivanje prisustva i koncentracije analita u uzorku.

Hromatogram

• Hromatogram je vizualni prikaz rezultata hromatografskog postupka. Svakoj supstanci odgovara određeni pik na hromatogramu.
• Hromatograf je instrument za hromatografiju.
• Eluent je komponenta separacijskog sistema koja pokreće uzorak kroz kolonu.
• Efluent je kompletna mobilna faza koja izlazi iz kolone.^[2]
• Mobilna faza je faza koja se kreće u određenom pravcu. Može biti tečna (LC) ili gasovita (GC). Mobilna faza se kreće kroz kolonu noseći uzorak koji se razdvaja.
• Preparativna hromatografija služi za prečišćavanje supstanci za određene svrhe (ne za analizu).
• Retenciono vrijeme je vrijeme za koje analit prođe kroz hromatografski sistem u određenim uslovima.
• Stacionarna faza je supstanca koja je fiksirana u koloni (GC i LC) ili ploči (npr. silikagel u TLC), na čijoj se površini određeno vrijeme zadržavaju supstance koje se razdvajaju.

Klasifikacija hromatografskih metoda

Hromatografske metode je moguće podijeliti prema različitim kriterijima: prema fizičkom stanju faza, prema fizičko-hemijskim fenomenima koji se dešavaju prilikom razdvajanja (mehanizmu razdvajanja), itd.^[3]

Podjela prema fizičkom stanju faza

Razdvajanje komponenata uzorka u koloni

• Tečna hromatografija:
  • Adsorpciona (tečno/čvrsto), npr. TLC, HPLC
  • Ionska
  • Ekskluziona
  • Particiona (tečno/tečno)
• Gasna hromatografija:
  • Gas/tečno
  • Gas/čvrsto
• Superkritična fluidna hromatografija

Podjela prema obliku sistema

• Kolonska hromatografija
• Planarna hromatografija, npr. TLC

Podjela prema mehanizmu razdvajanja

• Ionoizmjenjivačka (ionska) hromatografija
• Ekskluziona hromatografija

Tehnike

Gasna hromatografija

Shema uređaja za gasnu hromatografiju

Glavni članak: Gasna hromatografija

Gasna hromatografija (GC) je metoda razdvajanja i detekcije volatilnih organskih spojeva i nekih anorganskih gasova iz smjese. GC je nastala 1950. godine i danas se razvila u jednu od primarnih tehnika u hemijskoj analizi. U GC dolazi do particionisanja gasovitog uzorka između inertnog gasa kao mobilne faze i tečne ili čvrste stacionarne faze. Uređaj za GC se naziva gasni hromatograf. Kao mobilna faza (gas nosač) najčešće se upotrebljavaju helij, nitrogen, hidrogen ili smjesa argona i metana. Izbor gasa zavisi od uzorka i detektora, a najviše se koristi helij. Uzorak se unosi pomoću injektora (manualni ili automatski) i nošen gasom prelazi u kolonu. Kolone za GC koje su se u početku koristile su tzv. pakovane kolone. Danas su u upotrebi kapilarne kolone, zbog bolje efikasnosti razdvajanja. Unutrašnji zidovi kapilarne kolone su prevučeni čvrstim poroznim materijalom ili viskoznom tečnošću. U GC se koristi više tipova detektora, čiji se izbor vrši na osnovu komponente koja se analizira.^[4]

Shema uređaja za tečnu hromatografiju: A-rezervoar mobilne faze; B-ventil za miješanje i pumpa; C-drain ventil; D-uređaj za kontrolu pritiska; E-komora za miješanje (mikser); F-injektor; G-kolona; H-HPLC komponenta; I-detektor; J-kontroler; K-kompjuter; L-štampač

Tečna hromatografija

Glavni članak: HPLC

Tečna hromatografija (LC) je razdvajanje supstanci na osnovu distribucije između čvrste stacionarne faze i tečne mobilne faze. Postoje dva tipa LC: klasična i LC visokih performansi (HPLC). Klasična LC koristi velike kolone, dužine i do 50 cm, pakovane poroznim materijalom, a mobilna faza prolazi gravitaciono, pa je stoga mali protok i metoda nije efikasna. HPLC je moderna analitička tehnika kod koje se mobilna faza dovodi pomoću pumpe. Uzorak se ubacuje pomoću manualnog ili automatskog injektora. Kolone za HPLC su punjene silikatnim ili polimernim materijalom. Postoji više tipova detektora za HPLC. Najčešće se koristi UV-VIS detektor, a osim njega i fotodiodni, fluorescentni, elekrohemijski i drugi. Na osnovu polarnosti razlikuje se LC na normalnim i obrnutim fazama. Razdvajanje na normalnim fazama podrazumijeva da je stacionarna faza polarna (npr. silikatna), a mobilna faza nepolarna (npr heksan). Kod razdvajanja na obrnutim fazama stacionarna faza je nepolarna (npr. C-18 hidrokarbon), a mobilna faza polarna (npr. voda i metanol). ^[5]

TLC razdvajanje

Tankoslojna hromatografija

Glavni članak: Tankoslojna hromatografija

Tankoslojna hromatografija (TLC) koristi tanki sloj (0.10 – 0.25 mm) adsorbirajućeg materijala (silikagel, aluminij oksid, celuloza) nanesen na čvrsti nosač od stakla, aluminija ili plastike. Uzorak rastvoren u odgovarajućem rastvaraču se nanosi u vidu mrlje na jednu stranu ploče, na udaljenosti 1 cm od ivice. Ploča se unosi u komoru na čijem dnu se nalazi rastvarač koji kapilarnim silama prolazi kroz adsorbens noseći sa sobom komponente uzorka, koje se kreću do određene udaljenosti na ploči. Zbog različitog afiniteta komponente se zaustavljaju na različitim mjestima na ploči, što omogućava njihovu identifikaciju (razvijanjem boje ili posmatranjem pod UV lampom).^[3]

Uređaj za ionoizmjenjivačku hromatografiju

Ionoizmjenjivačka hromatografija

Glavni članak: Ionoizmjenjivačka hromatografija

Ionoizmjenjivačka hromatografija (IEC) ili ionska hromatografija je tehnika koja ima dosta sličnosti sa HPLC tehnikom. Kao stacionarna faza koriste se umrežene polimerne smole (najčešće polistirenske umrežene pomoću divinil-benzena), na koje su kovalentno vezane ionske funkcionalne grupe. Te grupe su neutralisane ionima suprotnog naboja i mogu biti zamijenjeni ionima koji su prisutni u ispitivanom uzorku. Zavisno od afiniteta, ioni će se različito vrijeme zadržavati na stacionarnoj fazi, što omogućava njihovo razdvajanje. Generalno, ionoizmjenjivač favorizira vezanje iona većeg naboja i manjeg radijusa. Kao mobilna faza najčešće se upotrebljavaju puferi.^[6]

Ekskluziona hromatografija

Ekskluziona hromatografija

Glavni članak: Ekskluziona hromatografija

Ekskluziona hromatografija je metoda kod koje se separacija komponenata vrši na osnovu veličine čestica. Kao stacionarna faza koriste se porozni materijali (silikagel ili polimerne smole). Manje čestice mogu ući u pore stacionarne faze i zadržavaju se duže vremena. Veće čestice koje su prisutne u uzorku ne mogu ući u pore i eliuraju se prije. Ovaj tip hromatografije se naziva još i gel-filtracija ili hromatografija na molekularnim sitima. Engleski naziv je size exclusion chromatography, pa se koristi akronim SEC. Ova metoda je pogodna za razdvajanje proteina.^[3]

Fazni dijagram za superkritični fluid

Superkritična fluidna hromatografija

Superkritična fluidna hromatografija (SFC) je metoda kod koje je mobilna faza gas na temperaturi i pritisku iznad kritičnih vrijednosti (pod ovim uslovima mobilna faza je superkritični fluid – niti je gas niti tečnost). Superkritični fluidi imaju viskoznost sličnu gasovima, pa lahko prolaze kroz kapilarne i pakovane kolone bez potrebe za visokim pritiskom kao kod HPLC metode. Gustoća superkritičnih fluida je slična tečnostima, pa se ponašaju kao rastvarač. Najčešće se koristi CO₂. Njegova kritična temperatura je 31 °C i kritični pritisak 72.9 atm što se relativno lahko postiže.^[6]