PCR en temps real
variant que es fa servir per amplificar i quantificar en termes absoluts el producte de l'amplificació d'ADN / From Wikipedia, the free encyclopedia
La PCR quantitativa, qPCR, Q-PCR[1] o PCR en temps real[2] és una variant de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) que es fa servir per amplificar i quantificar en termes absoluts el producte de l'amplificació, l'àcid desoxiribonucleic (ADN). Igual que en la PCR convencional, s'empra un motlle d'ADN, almenys un parell d'encebadors específics, dNTP, un amortidor de reacció adequat i una polimerasa d'ADN termoestable. S'afegeix a aquesta barreja una substància marcada amb un fluoròfor que, en un termociclador dotat de sensors per mesurar fluorescència, després de ser excitat a la longitud d'ona apropiada, permeti mesurar la taxa de generació d'un o més productes específics.[3] Aquest mesurament es fa després de cada cicle d'amplificació, motiu pel qual també se la denomina PCR en temps real. En molts casos el motlle emprat per la PCR quantitativa no és ADN des del principi, sinó que pot ser ADN complementari (ADNc) monocatenari, obtingut per retrotranscripció de l'àcid ribonucleic (ARN); en aquest cas, s'utilitzen les denominacions RT-PCR quantitativa, RT-PCR en temps real o RT-Q-PCR. No s'ha de confondre amb la tècnica de la PCR amb transcripció inversa[4] en què hi ha un pas de retrotranscripció d'ARN a ADN que no quantifica necessàriament el producte en temps real.[5]
Juntament amb els xips d'ADN, la PCR quantitativa és la metodologia més moderna per estudiar l'expressió gènica, tot i que altres mètodes tradicionals com el Northern blot també permeten observar-la amb una menor precisió.[6] La variabilitat introduïda a la quantificació, que comporta un marge d'error en l'estimació, deriva de la integritat de l'ADN, l'eficiència enzimàtica i molts altres factors, per la qual cosa s'han desenvolupat nombrosos sistemes d'estandardització. N'hi ha que quantifiquen de manera absoluta l'expressió gènica, però és més habitual que estiguin enfocats a la quantificació relativa del gen d'estudi respecte a un altre, denominat "normalitzador", que és seleccionat per la seva expressió gairebé constant. Aquests gens solen rebre el nom de "gens de manteniment" perquè sovint estant implicats en funcions bàsiques per a la supervivència cel·lular, cosa que sol comportar una expressió constitutiva.[7][8] Mesurant els gens d'interès a cada experiment i dividint el resultat per l'expressió del gen normalitzador seleccionat és possible comparar els gens objectiu, fins i tot sense conèixer-ne el nivell d'expressió en termes absoluts. Els gens normalitzadors més emprats són els que codifiquen proteïnes com la tubulina, la gliceraldehid-3-fosfat deshidrogenasa, l'albúmina, la ciclofilina o ARN ribosòmics.[6]