Lowry-Test

Der Lowry-Test ist eine biochemische Methode, um Proteine quantitativ zu bestimmen.^[1] Die Veröffentlichung über die Methode aus dem Jahr 1951 ist mit 305.148 Zitierungen der am häufigsten zitierte wissenschaftliche Artikel im Zeitraum von 1945 bis 2014.^[2][3][4]

Standardreihe von 0 bis 0,5 mg/ml BSA im Lowry-Test (oben) und Negativkontrolle und Probe (unten)

Prinzip

Der Lowry-Test beruht auf zwei Reaktionen. Der erste Schritt beruht auf der Biuretreaktion,^[5] nämlich auf der Bildung eines blauvioletten, quadratisch-planaren Farbstoffkomplexes zwischen den Peptidbindungen und Kupfer(II)-Ionen in einer alkalischen Lösung. In einem zweiten Schritt wird Cu(II) durch die Peptidbindung zu Cu(I) reduziert. Dieses Cu(I) wiederum reduziert das gelbe Folin-Ciocalteu-Reagenz (Molybdatophosphorsäure und Wolframatophosphorsäure / Heteropolysäuren) zu Heteropolymolybdänblau.^[6] Es können Proteinkonzentrationen von 0,1–1 µg Protein pro Milliliter bestimmt werden.^[7]

Der Anteil an der Aminosäure Cystein trägt zur Blaufärbung bei.^[8] Bezüglich der Zeitentwicklung der Blaufärbung nach Zugabe des Folin-Ciocalteu-Reagenz empfahl Lowry eine Wartezeit von 30 Minuten und dann die Extinktion bei 750 Nanometer zu messen. Die Intensität der Blaufärbung nimmt im Zeitraum zwischen 30 und 120 Minuten zu, zwischen 120 und 240 Minuten bleibt sie stabil und nimmt anschließend wieder ab.^[9] Darüber hinaus empfehle es sich die Lowry-Reagenzien mit Wasser statt mit Natriumhydroxid anzusetzen, dagegen jedoch die Proteinlösungen in 1 M Natriumhydroxid. Weiterhin seien zur Messung der Extinktion per Photometrie eine Wellenlänge von 660 Nanometern geeigneter als die üblichen 750 Nanometer. In der Literatur sind einige Verbesserungen und Weiterentwicklungen beschrieben worden. So hat Hartree 1972 eine Variante der Lowry-Methode vorgestellt, die u. a. die hohe Störanfälligkeit adressiert.^[10] Allerdings ist beim Lowry-Test (wie auch beim Bradford-Test und dem BCA-Test) die Auswahl eines geeigneten Proteins für die Standardreihe wichtig, ansonsten sollte über andere Methoden wie den Mikro-Kjeldahl, Aminosäureanalyse oder die Biuret-Reaktion quantifiziert werden.^[11]

Das Lowry-Reagenz besteht aus den wässrigen Stammlösungen A (100 g/L Natriumcarbonat, 0,5 M Natriumhydroxid), B (10 g/L Kupfersulfat-Pentahydrat) und C (20 g/L Kaliumtartrat), die in einem Mischungsverhältnis von 20:1:1 angesetzt werden.^[12] Das Lowry-Reagenz wird 1:1 mit der Probe vermischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.^[12] Anschließend erfolgt die Farbstoffbildung durch Zugabe des 1:10 verdünnten Folin-Ciocalteu-Reagenz in einem Verhältnis von 2:3 und einer Inkubation bei Raumtemperatur für 45 Minuten.^[12] Die resultierende intensive Färbung wird zur quantitativen Bestimmung der Proteinkonzentration mittels Photometrie bei 750 nm, 650 nm oder 540 nm vermessen.^[7]

Alternativen

Durch das Folin-Ciocalteu-Reagenz wird die Nachweisgrenze um den Faktor 100 im Vergleich zur Biuretreaktion gesenkt.^[12] Die Lowry-Methode ist wesentlich empfindlicher als die Biuret-Methode wegen ihrer zweiten, zusätzlichen Farbreaktion. Allerdings ist der Lowry-Test zeitaufwändiger und störanfälliger als die Biuretreaktion. So wird diese von nicht-proteinogenen Substanzen sowie von den häufig eingesetzten Stoffen EDTA, Triton X-100 oder Ammoniumsulfat gestört.^[7]

Im Vergleich zum BCA-Test^[13] ist die dort verwendete Bicinchoninsäure im alkalischen pH-Wert stabil, wodurch im Gegensatz zum Lowry-Test ein Arbeitsschritt weniger notwendig ist.^[14] Die Nachweisgrenze ist vergleichbar mit dem Lowry-Test.^[14] Weiterhin ist der BCA-Test weniger störanfällig gegenüber den Chaotropen Harnstoff und Guanidiniumchlorid, gegenüber den Salzen Ammoniumsulfat und Cäsiumhydrogencarbonat und gegenüber den Tensiden Triton X-100, SDS, Brij 35, Lubrol, CHAPS, CHAPSO und Octylglucosid.^[14]

Als weitere Alternative bietet sich die einfachere Proteinbestimmung nach Bradford an, die ähnlich empfindlich wie der Lowry-Test ist. Der Vorteil der Lowry-Methode und der BCA-Methode gegenüber der Methode nach Bradford ist, dass mit ihr auch Proteinkonzentrationen in Lösungen bestimmt werden können, die Natriumlaurylsulfat (SDS) enthalten, welches die Bestimmung nach Bradford behindern würde.^[15]

Geschichte

Der Lowry-Test wurde 1951 von Oliver Lowry, Nira J. Rosebrough, A. Lewis Farr und Rose J. Randall veröffentlicht.^[1] Er basiert auf der Biuret-Reaktion zur Proteinbestimmung von Allan G. Gornall, Charles J. Bardawill und Maxima M. David aus dem Jahr 1949^[16] und greift auf das Folin-Ciocalteu-Reagenz von Otto Folin und Vintilă Ciocâlteu aus dem Jahr 1927 zurück.^[17] Der BCA-Test ist eine Weiterentwicklung des Lowry-Tests und wurde 1985 von P. K. Smith und Kollegen veröffentlicht.^[18] BCA ersetzt beim BCA-Test das Folin-Ciocalteu-Reagenz im Lowry-Test.^[19]

Literatur

• G. L. Peterson: Review of the Folin phenol protein quantitation method of Lowry, Rosebrough, Farr and Randall. In: Analytical biochemistry. Band 100, Nummer 2, Dezember 1979, S. 201–220, doi:10.1016/0003-2697(79)90222-7, PMID 393128.