Poliadenilación

A poliadenilación é a adición dunha cola poli(A) (formada por moitas moléculas de adenosina monofosfato) a unha molécula de ARNm. A cola de poli(A) consiste, pois, nun tramo de ARN formado exclusivamente por AMPs unidas en cadea, que se engade nun dos extremos da molécula de ARN, o extremo 3'. Nos eucariotas a poliadenilación é parte do proceso que produce os ARN mensaxeiros maduros destinados á tradución nos ribosomas para formar proteínas. É unha parte do proceso de expresión xenética.

Estrutura dun ARNm eucariótico maduro típico. No extremo 3' está a cola poli(A).

O proceso de poliadenilación empeza cando finaliza a transcrición dun xene. O segmento situado máis ao extremo 3' do ARN acabado de sintetizar é primeiro cortado por un conxunto de proteínas; despois estas proteínas sintetizan a cola poli(A) en dito extremo 3'. Nalgúns xenes, estas proteínas poden engadir unha cola poli(A) en calquera dunha serie de sitios posibles. Por tanto, a poliadenilación pode producir máis dun transcrito para un só xene (poliadenilación alternativa), o que é similar ao splicing alternativo.^[1]

A cola poli(A) é importante para a exportación nuclear, tradución, e estabilidade do ARNm. A cola vaise acurtando co tempo, e, cando xa é demasiado curta, o ARNm é degradado encimaticamente.^[2] Porén, nuns poucos tipos celulares, os ARNm con colas poli(A) curtas almacénanse para unha posterior activación por repoliadenilación no citosol.^[3] Polo contrario, cando a poliadenilación ocorre en bacterias, o que fai é promover a degradación do ARN.^[4] Isto tamén ocorre algunhas veces nos ARN non codificantes eucarióticos.^[5]

Poliadenilación nuclear

Función

Na poliadenilación nuclear, engádese unha cola poli(A) a un ARN ao finalizar a transcrición. A cola poli(A) protexe a molécula de ARNm da degradación encimática no citoplasma e axuda á terminación da transcrición, exportación do ARNm desde o núcleo, e a tradución.^[2] Case todos os ARNm eucarióticos se poliadenilan,^[6] coa excepción dos ARNm de histonas dependentes da replicación animais.^[7] Estes son os únicos ARNm eucarióticos que carecen de cola poli(A), e no seu lugar acaban nunha estrutura en talo-bucle seguida dunha secuencia rica en purinas, denominada elemento corrente abaixo de histona, que dirixe onde se cortará o ARN para que se forme o extremo 3' do ARNm de histonas.^[8]

Moitos ARN non codificantes eucarióticos son sempre poliadenilados ao final da transcrición. Hai pequenos ARN nos que a cola poli(A) só se ve en formas intermediarias e non nos ARNs maduros, xa que os extremos son eliminados durante o procesamento, e os máis notables deles son os microARNs.^[9][10] Pero, en moitos ARN non codificantes longos  (un grupo aparentemente grande de ARNs regulatorios que, por exemplo, inclúe o ARN Xist, que media a inactivación do cromosoma X ) a cola poli(A) é parte do ARN maduro.^[11]

Mecanismo

Proteínas implicadas:[6] CPSF: factor de especificidade de clivaxe/poliadenilación CstF: factor de estimulación de clivaxe PAP: poliadenilato polimerase PAB2: proteína que se une ao poliadenilato 2 CFI: factor de clivaxe I CFII: factor de clivaxe II

A maquinaria de poliadenilación no núcleo de eucariotas actúa sobre os produtos orixinados pola ARN polimerase II, como son os ARNm precursores. Aquí, un complexo multiproteico (cuxos compoñentes poden verse na táboa da dereita) clivan a parte final do extremo 3' do ARN que se acaba de formar, e poliadenila o extremo que se orixina por esta clivaxe. A clivaxe está catalizada polo encima CPSF^[7] e ten lugar 10–30 nucleótidos "corrente abaixo" do seu sitio de unión.^[12] Este sitio é xeralmente a secuencia AAUAAA do ARN, pero hai variantes del aos que tamén se une máis debilmente o CPSF.^[13] Outras dúas proteínas que engaden especificidade á unión a un ARN son CstF e CFI. O CstF únese a unha rexión rica en GU situada máis "corrente abaixo" do sitio do CPSF.^[14] O CFI recoñece un terceiro sitio no ARN (un conxunto de secuencias UGUAA en mamíferos^[15][16][17]) e pode recrutar o CPSF mesmo se se perde a secuencia AAUAAA.^[18][19] O sinal de poliadenilación (a secuencia motivo recoñecida polo complexo de clivaxe do ARN) varía entre grupos de eucariotas. A maioría dos sitios de poliadenilación humanos conteñen a secuencia AAUAAA,^[14] pero esta secuencia é menos común en plantas e fungos.^[20]

O ARN clívase inmediatamente despois da súa transcrición, xa que o CstF tamén se une á ARN polimerase II.^[21] A clivaxe tamén implica á proteína CFII, aínda que non se sabe como.^[22] O sitio de clivaxe asociado co sinal de poliadenilación pode variar ata nuns 50 nucleótidos.^[23]

Cando o ARN está clivado, comeza a poliadenilación, catalizada pola poliadenilato polimerase. A poliadenilato polimerase fabrica a cola poli(A) engadindo ao ARNm unidades de adenosina monofosfato a partir de moléculas de adenosina trifosfato das que se libera un pirofosfato.^[24] Outra proteína, a PAB2, únese á nova cola poli(A) curta e incrementa a afinidade da poliadenilato polimerase polo ARN. Cando a cola poli(A) é de aproximadamente dunha lonxitude de 250 nucleótidos o encima xa non pode unirse ao CPSF e a poliadenilación detense, determinando así a lonxitude da cola poli(A).^[25][26] O CPSF está en contacto coa ARN polimerase II, o que lle permite sinalar á polimerase para rematar a transcrición.^[27][28] Cando a ARN polimerase II chega a unha "secuencia de terminación" (TTATT no molde de ADN e AAUAAA no transcrito primario), quede sinalado o final da transcrición.^[29] A maquinaria de poliadenilación está tamén ligada fisicamente ao espliceosoma, un complexo que elimina os intróns dos ARNs.^[19]

Efectos "corrente abaixo"

A cola poli(A) actúa como sitio de unión para a proteína de unión á poli(A). A proteína de unión á poli(A) promove a exportación desde o núcleo celular e a tradución, e inhibe a degradación.^[30] Esta proteína únese á cola poli(A) antes da exportación do ARNm desde o núcleo e nos lévedos tamén recruta a poli(A) nuclease, un encima que acurta a cola poli(A) e permite a exportación do ARNm. A proteína de unión á poli(A) é exportada ao citoplasma co ARN. Os ARNm que non se exportan son degradados polo complexo exosoma.^[31][32] A proteína de unión ao poli(A) tamén pode unirse (e recrutar) a varias proteínas que afectan á tradución,^[31] unha delas é o factor de iniciación-4G, que á súa vez recruta a subunidade ribosómica do 40S.^[33] Porén, a cola poli(A) non se require para a tradución de todos os ARNm.^[34]

Desadenilación

Nas células eucarióticas somáticas a cola poli(A) da maioría dos ARNm do citoplasma vaise acurtando gradualmente, e os ARNm con colas poli(A) máis curtas son traducidos menos e degradados antes.^[35] Porén, poden pasar moitas horas antes de que se degrade o ARNm.^[36] Este proceso de desadenilación e degradación pode ser acelerado por microARNs complementarios da rexión non traducida 3' (3'UTR) dun ARNm.^[37] Nas células ovo inmaturas, os ARNm con colas poli(A) acurtadas non son degradados, senón que son almacenados sen que sexan traducidos. Serán despois activados por poliadenilación citoplasmática despois da fertilización, durante a activación do ovo.^[38]

En animais, a poli(A) ribonuclease (PARN) pode unirse ao extremo 5' cap e eliminar nucleótidos da cola poli(A). O nivel de acceso ao 5' cap e á cola poli(A) é importante no control da rapidez en que se degrada o ARNm. A PARN desadenila menos se o ARN se uniu aos factores de iniciación 4E (no 5' cap) e 4G (na cola poli(A)), o cal explica por que a tradución reduce a desadenilación. O grao de desadenilación pode tamén regularse por proteínas que se unen ao ARN. Unha vez que se elimina a cola poli(A), o complexo que elimina o cap corta este, o que levará á degradación do ARN. Nos lévedos ideníficáronse outros encimas que parecen estar implicados na desadenilación.^[39]

Poliadenilación alternativa

Resultados de usar diferentes sitios de poliadenilación no mesmo xene.

Moitos xenes que codifican proteínas teñen máis dun sitio de poliadenilación, de modo que un xene pode codificar varios ARNm distintos que difiren nos seus extremos 3'.^[20][40][41] Como a poliadenilación alternativa cambia a lonxitude das rexións non traducidas 3', pode cambiar os sitios de unión para os microARNs que contén a rexión non traducida 3'.^[12][42] Os microARNs tenden a reprimir a tradución e promover a degradación dos ARNm aos que se unen, aínda que hai exemplos de microARNs que estabilizan os transcritos.^[43][44] A poliadenilación alternativa pode tamén acurtar a rexión codificante, facendo así que o ARNm codifique para unha proteína diferente,^[45][46] pero isto é moito menos común que simplemente acurtar a rexión non traducida 3'.^[20]

A elección do sitio da poli(A) pode estar influenciada por estímulos extracelulares e depende da expresión das proteínas que toman parte na poliadenilación.^[47][48] Por exemplo, a expresión de CstF-64, unha subunidade do factor estimulatorio da clivaxe (CstF), increméntase nos macrófagos en resposta aos lipopolisacáridos (un grupo de compostos bacterianos que desencadea respostas inmunitarias). Isto dá lugar á selección dos sitios poli(A) débiles e, por tanto, de transcritos máis curtos. Isto elimina os elementos regulatorios nas rexións non traducidas 3' dos ARNm para produtos relacionados coa defensa do organismo como o encima lisozima e o TNF-α. Estes ARNm despois teñen unha vida media máis longa e producen maior cantidade desas proteínas.^[47] Outras proteínas de unión ao ARN diferentes ás da maquinaria de poliadenilación poden tamén afectar a se un sitio de poliadenilación vai ser usado ou non,^{[49][50][51][52]} xa que poden metilar o ADN preto do sinal de poliadenilación.^[53]

Poliadenilación citoplasmática

Prodúcese poliadenilación no citosol dalgúns tipos de células animais, principalmente da liña xerminal, durante as primeiras fases da embrioxénese e nos sitios postsinápticos das neuronas. Esta poliadenilación alonga as colas poli(A) dos ARNm que teñen unha cola poli(A) curta, para que o ARNm poida ser traducido a proteínas.^[35][54] Estas colas poli(A) acurtadas dos ARNm teñen xeralmente menos de 20 nucleótidos, e sofren un alongamento ata os 80–150 nucleótidos.^[3]

Nas fases iniciais do embrión de rato a poliadenilación citoplasmática de ARNs maternos procedentes da célula ovo permite á célula sobrevivir e crecer aínda que a transcrición non empece ata a metade do estadio de dúas células (de 4 células no caso humano).^[55][56] No cerebro a poliadenilación citoplasmática é activa durante a aprendizaxe e podería xogar un papel na potenciación a longo prazo, que é o fortalecemento da transmisión do sinal dunha neurona a outra en resposta aos impulsos nerviosos e é importante para a aprendizaxe e formación da memoria.^[3][57]

A poliadenilación citoplasmática require as proteínas de unión ao ARN CPSF e CPEB, e pode implicar a outras proteínas de unión ao ARN como a Pumilio.^[58] Dependendo do tipo celular, a polimerse pode ser do mesmo tipo da poliadenilato polimerase (PAP) utilizada no proceso nuclear, ou ben a polimerase citoplasmática GLD-2.^[59]

Etiquetado para a degradación en eucariotas

Para moitos ARN non codificantes, como o ARN transferente, ARN ribosómico, ARN nuclear pequeno, e ARN nucleolar pequeno, a poliadenilación é un modo de marcar o ARN para a degradación, en organismos como Saccharomyces cerevisiae.^[60] Esta poliadenilación faise no núcleo pola acción do complexo TRAMP, que engade unha cola de arredor de 40 nucleótidos ao extremo 3'.^[61] O ARN é despois degradado polo complexo exosoma.^[62] As colas poli(A) atopártonse tamén en fragmentos de ARNr humanos, tanto na forma homopolimérica (só con A) coma na heteropolimérica (principalmente A).^[63]

En procariotas e orgánulos

En moitas bacterias, poden poliadenilarse tanto os ARNm coma os ARNs non codificantes. Esta formación de colas poli(A) promove a degradación polo degradosoma, o cal contén dous encimas que degradan o ARN: polinucleótido fosforilase e RNase E. A polinucleótido fosforilase únese ao extremo 3' de ARNs e a extensión 3' proporcionada pola cola poli(A) permítelle unirse aos ARNs cuxa estrutura secundaria bloquearía o extremo 3'. Roldas sucesivas de poliadenilación e degradación do extremo 3' pola polinucleótido fosforilase permiten que o degradosoma venza o atranco destas estruturas secundarias. A cola poli(A) pode tamén recrutar RNases que cortan o ARN en dous.^[64] Estas colas poli(A) bacterianas son de aproximadamente 30 nucleótidos de longo.^[65]

En grupos tan diferentes coma os animais e os tripanosomas, as mitocondrias conteñen tanto colas poli(A) estabilizadoras coma desestabilizadoras. A poliadenilación desestabilizadora afecta a ARNm e a ARN non codificantes. As colas poli(A) teñen como media un tamaño de 43 nucleótidos. As colas estabilizadoras empezan no codón de finalización, e sen elas o codón de finalización (UAA) non está completo, xa que o xenoma só codifica a parte do U ou UA. As mitocondrias das plantas teñen só poliadenilación desestabilizante, e as mitocondrias de lévedos carecen de poliadenilación.^[66]

Aínda que moitas bacterias e as mitocondrias teñen poliadenilato polimerases, tamén teñen outro tipo de poliadenilación, realizada pola propia polinucleótido fosforilase. Este encima atópase en bacterias,^[67] mitocondrias,^[68] plastidios^[69] e como constituínte do complexo exosoma de arqueas (das arqueas que o teñen).^[70] Pode sintetizar unha extensión 3' na que a gran maioría das bases son adeninas. Igual que en bacterias, a poliadenilación pola polinucleótido fosforilase promove a degradación do ARN en plastidios^[71] e probablemente tamén en arqueas.^[66]

Evolución

Aínda que a poliadenilación se dá en case todos os organismos, non é universal.^[72][73] Porén, a ampla distribución desta modificación entre os seres vivos e o feito de que estea presente en especies dos tres dominios da vida implica que o último antepasado común universal de todos os seres vivos tiña algún tipo de sistema de poliadenilación.^[65] Hai uns poucos organismos que non poliadenilan o ARNm, o cal implica que perderon as súas maquinarias de poliadenilación durante a súa evolución. Aínda que non se coñecen exemplos de eucariotas que carezan de poliadenilación, os ARNm da bacteria Mycoplasma gallisepticum e a arquea halotolerante (tolerante ao sal) Haloferax volcanii carecen desta modificación.^[74][75]

O encima para a poliadenilación máis antigo é a polinucleótido fosforilase. Este encima forma parte do degradosoma bacteriano e do complexo exosoma arqueano,^[76] dous complexos encimáticos moi relacionados que reciclan o ARN en nucleótidos. Este encima degrada o ARN ao atacar os enlaces entre os nucleótidos que están no extremo 3' cun fosfato, escindindo un nucleótido difosfato. Esta reacción é reversible, e deste xeito o encima pode tamén estender o ARN engadindo máis nucleótidos. A cola heteropolimérica que engade a polinucleótido fosforilase é moi rica en adenina. A elección da adenina é moi probablemente o resultado das maiores concentracións que hai na célula de ADP en comparación coa doutros nucleótidos como resultado da utilización no metabolismo do ATP como fonte directa de enerxía, o que fixo que fose esta molécla a que se incorporou con maior probabilidade na cola dos ARN en todas as primeiras formas de vida. Suxeriuse que a implicación das colas ricas en adenina na degradación do ARN levou á posterior evolución das poliadenilato polimerases (os encimas que producen as colas poli(A) só con bases de adenina).^[77]

As poliadenilato polimerases non son tan antigas. Evolucionaron separadamente en bacterias e eucariotas a partir do encima que engade CCA, o cal é o encima que completa os extremos 3' dos ARNt. O seu dominio catalítico é homólogo ao doutras polimerases.^[62] Pénsase que a transferencia horizontal do encima que engade CCA bacteriano aos eucariotas permitiu que o encima que engade CCA de tipo arqueano mudase a súa función ao dunha poli(A) polimerase.^[65] Nalgunhas liñaxes de seres vivos, como as arqueas e as cianobacterias, nunca evolucionou unha poliadenilato polimerase.^[77]

Historia

A poliadenilación identificouse en 1960 como unha actividade encimática en extractos feitos de núcleos celulares que podían polimerizar ATP, pero non ADP, formando poliadenina.^[78][79] Aínda que se identificou en moitos tipos de células, non se coñeceu a función desta actividade ata 1971, cando se encontraron secuencias de poli(A) en ARNm.^[80][81] Pensouse ao primeiro que a única función destas secuencias era a protección dos extremos 3' do ARN dos efectos das nucleases, pero máis tarde identificáronse os papeis da poliadenilación na exportación nuclear e tradución. As polimerases responsables da poliadenilación foron purificadas e caracterizadas nas décadas de 1960 e 1970, pero o gran número de proteínas accesorias que controlan este proceso non se descubrirían ata a década de 1990.^[80]