Cromosoma artificial bacteriano

O cromosoma artificial bacteriano (CAB ou, en inglés, BAC) é un vector de clonación usado para clonar fragmentos de ADN (de 100 a 300 kb de tamaño; como media 150 kb)^[1] na bacteria Escherichia coli, creado a partir do plásmido factor F encontrado de modo natural na mencionada bacteria^[2][3].

É un dos tipos de vectores de clonación coñecidos como "vectores de alta capacidade", entre os que ademais se inclúen os cósmidos, PACs (cromosoma artificial derivado do ADN do bacteriófago P1) e YACs (cromosoma artificial de lévedo), por contraposición cos "vectores de baixa capacidade", como plásmidos, vectores derivados do fago lambda, faxémidos e fósmidos.

Os cromosomas artificiais bacterianos son moi utilizados como vectores de clonación para a construción de xenotecas (bibliotecas xenómicas), como no Proxecto Xenoma Humano. A súa frecuente utilización débese á súa notable capacidade, grande estabilidade e baixa porcentaxe de quimerismo. Tamén se usan no estudo de enfermidades hereditarias e para a clonación de xenomas de axentes infecciosos como virus^[4][5][6].

Dado o gran tamaño dos CAB (ou BAC) recombinantes, as estratexias para a súa introdución na célula máis eficientes son as que utilizan a electroporación (aplícanse correntes eléctricas á membrana celular para que se formen poros que permitan o paso de substancias).

Un cromosoma artificial bacteriano típico consta de:

• OriS: orixe de replicación do factor F
• repE: control da replicación do plásmido
• parA, B, C: control da replicación
• CMr: cloranfenicol acetil-transferase (CAT) (xene de resistencia ao cloranfenicol)
• LacZ’: xene cun polilinker (que contén múltiples sitios de restrición) no seu interior. Utilízase para o ensaio de alfa-complementación.

Procedemento de clonación

Para realizar a clonación dun xene hai que seguir o seguinte procedemento:

• a) Córtase o vector co encima de restrición HindIII para abrir o plásmido e facelo lineal.
• b) Desfosforílanse os extremos 5’ do vector para evitar a autoligación.
• c) Dixírese a nosa mostra con HindIII ou outro encima compatible. Selecciónanse os fragmentos segundo o seu tamaño por electroforese e purifícanse.
• d) Lévase a cabo a reacción de ligación.
• e) Transfírense os vectores a unha célula por electroporación.
• f) Selección dos clons nun medio con cloranfenicol e X-gal. Son positivos os que sobreviven en cloranfenicol e carecen de actividade de beta-galactosidase.