Operón trp

O operón trp é un operón, é dicir, un grupo de xenes que se utilizan ou transcriben xuntos de forma regulada, que codifica os compoñentes necesarios para a produción do aminoácido triptófano. O operón trp está presente en moitas bacterias, e foi primeiramente caracterizado na especie Escherichia coli. Este operón está regulado para que cando o triptófano estea presente no ambiente, os xenes para a súa síntese non funcionen, e cando non estea presente si. Foi un importante sistema experimental para comprender a regulación xénica e utilízase frecuentemente para explicala.

Estrutura do operón trp

O operón trp contén cinco xenes estruturais: trpE, trpD, trpC, trpB e trpA, que codifican compoñentes enzimáticos da vía metabólica. Tamén contén un xene regulador represivo chamado trpR. O trpR ten un promotor ao que se une a ARN polimerase e sintetiza o ARNm dunha proteína regulatoria. A proteína que se sintetiza a partir do trpR únese despois ao operador, o que causa o bloqueo da transcrición. No operón trp, o triptófano únese á proteína represora bloqueando a transcrición do xene. Nesta situación, a represión significa que a ARN polimerase vai transcribir os xenes do operón. Ademais, a diferenza do que ocorre no operón lac, o operón trp contén un péptido líder e unha secuencia atenuadora, que permite unha regulación graduada.^[1]

É un exemplo de regulación negativa represible da expresión xénica. Dentro da secuencia regulatoria do operón, o operador é bloqueado pola proteína represora en presenza de triptófano (o que impide a transcrición e a formación de máis triptófano, xa que xa hai dabondo) e é liberado do bloqueo en ausencia de triptófano (permitindo así a transcrición).

Xenes

O operón trp consta de cinco xenes estruturais, cuxas funcións son:

• TrpE (P00895): xene da antranilato sintase, que produce antranilato.
• TrpD (P00904): coopera con TrpE.
• TrpC (P00909): xene dun enzima bifuncional. O seu dominio de fosforribosilantranilato isomerase, primeiro converte o N-(5-fosfo-β-D-ribosil)antranilato en 1-(2-carboxifenilamino)-1-desoxi-D-ribulosa 5-fosfato. A porción de indol-3-glicerol-fosfato sintase da mesma proteína converte ese produto en (1S,2R)-1-C-(indol-3-il)glicerol 3-fosfato.
• TrpA (P0A877), TrpB (P0A879): xenes de dúas subunidades da triptófano sintetase, cadea alfa e beta, respectivamente. Combina o produto do TrpC con serina para orixinar triptófano.

Represión

O represor Trp dímero unido ao operador de ADN

O operón funciona por medio dun mecanismo de retroalimentación represible negativa. O represor do operón trp prodúcese augas arriba no xene trpR, que se expresa constitutivamente a baixo nivel. Os monómeros de trpR sintetizados asócianse formando dímeros. Cando está presente o triptófano, estes dímeros represores do triptófano únense ao triptófano, causando un cambio na conformación do represor, que permiten que o represor se una ao operador. Isto impide que a ARN polimerase se una e transcriba o operón, polo que o triptófano non se produce a partir do seu precursor. Cando non está presente o triptófano, o represor está na súa conformación activa e non pode unirse á rexión operadora, polo que a transcrición non é inhibida polo represor.

Atenuación

Mecanismo de atenuacón transcricional do operón trp.

A atenuación é un segundo mecanismo de retroalimentación negativa no operón trp. O sistema de represión depende da concentración intracelular de triptófano, mentres que a atenuación responde á concentración de moléculas cargadas con triptófano de ARNt^trp.^[2] Así, o represor trpR diminúe a expresión xénica alterando a iniciación da transcrición, mentres que a atenuación faino alterando o proceso de transcrición que xa está en progreso.^[2] Mentres que o represor TrpR diminúe a transcrición nun factor de 70, a atenuación pode diminuílo adicionalmente nun factor de 10, o que permite chegar a unha represión total 700 veces maior.^[3] A atenuación faise posible porque en procariotas (que non teñen núcleo celular), os ribosomas empezan a traducir o ARNm cando a ARN polimerase está aínda transcribindo a secuencia de ADN. Deste modo, o proceso de tradución afecta directamente a transcrición do operón.

Na parte inicial dos xenes transcritos do operón trp hai unha secuencia de polo menos 130 nucleótidos denominada transcrito líder (trpL; P0AD92 ).^[4] Lee e Yanofsky (1977) descubriron que a atenuación está eficazmente correlacionada coa estbilidade dunha estrutura secundaria incrustada no trpL,^[5] e as forquitas constituíntes da estrutura terminadora foron despois determinadas por Oxender et al. (1979).^[6] Este transcrito inclúe catro curtas secuencias designadas do 1 ao 4, cada unha das cales é parcialmente complementaria coa seguinte. Así, poden formarse tres estruturas secundarias distintas (forquitas): 1–2, 2–3 ou 3–4. A hibridación das secuencias 1 e 2 para formar a estrutura 1–2 é rara porque a ARN polimerase espera a que o ribosoma se una antes de continuar a transcrición despois da secuencia 1, porén se se forma a forquita 1–2, isto impediría a formación da estrutura 2–3 (pero non a da 3–4). A formación dun bucle forquita entre as secuencias 2–3 impide a formación de bucles forquita entre 1–2 e 3–4. A estrutura 3–4 é unha secuencia de terminación da transcrición (rica en G/C e inmediatamente seguida de varios residuos de uracilo), unha vez que se forma a ARN polimerase disóciase do ADN e a transcrición do ADN dos xenes estruturais do operón non se pode producir (véxase máis adiante unha explicación máis detallada). A importancia funcional da segunda forquita para a terminación da transcrición queda ilustrada pola redución na frecuencia de terminación da transcrición observada en experimentos que desestabilizan o apareamento G+C central desta forquita.^[5][7][8][9]

Parte do transcrito líder codifica un curto polipéptido de 14 aminoácidos denominado péptido líder. Este péptido contén dous residuos de triptófano adxacentes, o cal é pouco común, xa que o triptófano é un aminoácido bastante pouco frecuente (só un de cada cen residuos son de triptófano nunha proteína típica de Escherichia coli). A febra 1 do trpL comprende a rexión que codifica os residuos de cola do péptido líder: Trp, Trp, Arg, Thr, Ser;^[2] observouse unha conservación nestes 5 codóns, mentres que se comprobou que mutar os codóns de augas arriba non altera a expresión do operón.^{[2][10][11][12]} Se o ribosoma intenta traducir este péptido cando os niveis de triptófano na célula son baixos, quedará bloqueado nun dos dous codóns trp. Mentres está parado alí, o ribosoma cobre fisicamente a secuencia 1 do transcrito, impedindo a formación da estrutura secundaria 1–2. A secuencia 2 queda entón libre para hibridarse coa secuencia 3 e formar a estrutura 2–3, o cal imposibilita a formación da forquita de terminación 3–4, polo cal a estrutura 2–3 se chama forquita antiterminación. En presenza da estrutura 2–3, a ARN polimerase pode continuar trancribindo o operón. A análise mutacional e os estudos que usan oligonucleótidos complementarios demostran que a estabilidade da estrutura 2–3 se corresponde co nivel de expresión do operón.^{[10][13][14][15]} Se os niveis de triptófano na célula son altos, o ribosoma traducirá o péptido líder completo sen interrupción e só se detén durante a terminación da tradución no codón de terminación. Nese punto o ribosoma cobre fisicamente as secuencias 1 e 2. As secuencias 3 e 4 quedan así libres para formar a estrutura 3–4 que termina a transcrición. Esta estrutura terminadora fórmase cando ningún ribosoma está detido na veciñanza do tándem de triptófanos (é dicir, un codón de Trp ou de Arg): ou o péptido líder non se traduce ou a tradución avanza de vagariño pola febra 1 con abundantes moléculas cargadas de triptófano de ARNt^trp.^[2][10] Ademais, propúxose que o ribosoma só bloquea uns 10 nucleótidos augas abaixo, así a detención do ribosoma, xa sexa na secuencia Gly ou xa sexa na Thr situada máis augas abaixo, non parece afectar a formación da forquita de terminación.^[2][10] O resultado final é que operón se transcribirá soamente cando o ribosoma non dispón de triptófano, mentres que o transcrito trpL se expresa constitutivamente.

Este mecanismo de atenuación está apoiado experimentalmente. Primeiro, a tradución do péptido líder e a parada do ribosoma probaron ser directamente necesarios para inhibir a terminación da transcrición.^[13] Ademais, a análise mutacional que desestabiliza ou altera o apareamento de bases da forquita antiterminador ten como resultado un incremento na terminación; isto é consistente co modelo de atenuación, esta mutación non pode aliviar a atenuación mesmo se hai escaseza de triptófano (Trp).^[10][13] En contraste con isto, oligonucleótidos complementarios dirixidos á febra 1 aumentan a expresión do operón ao promocionaren a fomación do antiterminador.^[10][14] Ademais, no operón da histidina, a mutación complementaria mostra que a capacidade de apareamento das febras 2–3 ten máis importancia que as súas secuencias primarias á hora de inhibir a atenuación.^[10][15]

Na atenuación, o punto onde o ribosoma que está traducindo queda parado determina se se formará unha forquita de terminación.^[10] Para que a polimerase en transcrición capture ao mesmo tempo a estrutura alternativa, a escala de tempo da modulación estrutural debe ser comparable coa da transcrición.^[2] Para asegurar que o ribosoma se une e empeza a tradución do transcrito líder inmediatamente despois de que este se sintetiza, existe un sitio de pausa na secuencia trpLe. Unha vez chegado a este sitio, a ARN polimerase fai unha pausa na transcrición e aparentemente agarda a que empece a tradución. Este mecanismo posibilita unha sincronización da transcrición e da tradución, o cal é un elemento clave na atenuación.

Un mecanismo de atenuación similar regula as sínteses da histidina, fenilalanina e treonina.