Western blot

Western blot, western blotting, immunoblotting – metoda stosowana w biologii molekularnej służąca do wykrywania określonych białek. Technika ta obejmuje przygotowanie próbek z mieszaniną białek, elektroforezę, przeniesienie rozdzielonych białek z żelu na membranę, inkubację z odpowiednimi przeciwciałami i detekcję pożądanego białka.

Przykładowy western blot – ekspozycja na kliszy fotograficznej z użyciem drugorzędowych przeciwciał sprzężonych z peroksydazą chrzanową, katalizującą chemiluminescencję

Procedura

Przygotowanie próbek

Badane białka muszą zostać uwolnione z komórek przy użyciu technik rozbijania tkanek lub dezintegracji komórek, a następnie oczyszczania białek. Dla lepszego rozpuszczenia białek dodaje się czynniki chaotropowe, redukujące, detergenty, bufory, sole. Następnie określa się stężenie białek w próbkach, aby użyć odpowiednich ilości w elektroforezie^[1].

Elektroforeza

Żel po elektroforezie z widocznymi prążkami markera masy oraz białek wybarwionych błękitem Coomassie

Próbki poddaje się elektroforezie w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS (SDS-PAGE). Zdenaturowane białka w wyniku tego procesu zostają rozdzielone według ich mas cząsteczkowych. Mają one postać serii prążków na żelu^[2], które można zwizualizować przez barwienie błękitem Coomassie lub srebrem^[3].

Rzadziej stosuje się elektroforezę w niedenaturujących warunkach, bez SDS^[4]. Na rozdział taki ma wpływ wtedy również natywny ładunek białka, ponadto interakcje między białkami, więc skutek takiego rozdziału jest nieprzewidywalny (na przykład jedne białka mogą migrować w stronę jednej elektrody, inne w stronę drugiej)^[1].

Elektrotransfer białek

Następnie rozdzielone białka w żelu zostają przeniesione (odciśnięte, ang. blotting) w wyniku działania pola elektrycznego na membranę, gdzie zostają związane^[2]. Używa się w tym celu najczęściej membrany nitrocelulozowej lub PVDF^[5]. Membrany PVDF są bardziej wytrzymałe mechanicznie i mniej wrażliwe na działanie rozpuszczalników organicznych. Najrzadziej używanymi membranami w immunoblottingu są membrany nylonowe. Efektywność przeniesienia białek z żelu na membranę można ocenić, wybarwiając ją odwracalnie pąsem S (Ponceau S). Po obserwacji barwnik można szybko usunąć przez przemywanie i przystąpić do dalszych analiz^[6].

Wyróżnia się dwa typy elektrotransferu – mokry i półsuchy. Transfer mokry przebiega w naczyniu wypełnionym buforem^[7]. Żel, membrana i bibuły Whatmana tworzące „kanapkę” pomiędzy dwiema elektrodami ułożone są pionowo. Przy dłuższym transferze (ponad godzinnym) przeprowadzanym w taki sposób konieczne jest chłodzenie^[8].

W przypadku elektrotransferu półsuchego „kanapka” żel-membrana obłożona jest kilkoma warstwami bibuły Whatmana nawilżonej buforem^[7] i ułożona w pozycji poziomej^[8]. W ten sposób białka przenoszone są szybciej, zwykle taniej, potrzeba mniej buforu i można stosować różne bufory po stronie anody i katody. Z reguły jednak wydajność przeniesienia białek jest niższa^[7].

Podstawowym buforem w elektrotransferze białek jest bufor Tris-glicyna, na ogół o pH wyższym niż pI przenoszonych białek. Stosuje się także dodatki w postaci metanolu lub SDS. SDS przyśpiesza migrację białek, ale może osłabiać wiązanie białek do membrany. Metanol ułatwia dysocjację kompleksów SDS-białko, wzmacnia wiązanie białek do membrany, ale może powodować denaturację dużych białek, obniżać wydajność przenoszenia białek, chemicznie je modyfikować^[9].

Użycie przeciwciał

Membranę z białkami inkubuje się w roztworze odtłuszczonego mleka w proszku^[5], kazeiny^[2] lub albuminy z surowicy wołowej^[1]. Substancje te rozpuszcza się w buforze stosowanym do przemywania membrany, który składa się z TBS lub PBS i niejonowego detergentu, na przykład Tween 20)^[5]. Mieszanina ta to tak zwany bufor blokujący, który ostatecznie wybierany jest na drodze empirycznej^[10]. Dzięki niemu blokowana jest możliwość niespecyficznego wiązania się przeciwciał do membrany^[2].

Następnie membranę inkubuje się z przeciwciałem związanym ze znacznikiem (metoda bezpośrednia) lub z dwoma rodzajami przeciwciał: nieznakowanym, specyficznym, rozpoznającym pożądane białko (przeciwciało pierwszorzędowe) oraz znakowanym, rozpoznającym przeciwciało pierwszorzędowe (przeciwciało drugorzędowe)^[11].

Przeciwciała drugorzędowe rozpoznają epitopy charakterystyczne dla przeciwciał gatunku, z którego pozyskano przeciwciała pierwszorzędowe^[12]. Przykładowo jeśli pierwszorzędowe przeciwciała pochodzą od myszy, przeciwciała drugorzędowe powinny pochodzić od innego zwierzęcia, np. kozy, i być skierowane przeciw przeciwciałom myszy^[11]. Taki dwustopniowy system detekcji pozwala oszczędzić czas i jest tańszy^[12]. Przeciwciała swoiste wobec konkretnego białka są bowiem unikalne, więc i kosztowne, a znakowanie we własnym zakresie pociąga za sobą straty. Roztwór do rozcieńczenia przeciwciała często jest taki sam jak bufor blokujący. Stosunek rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego ustalany jest eksperymentalnie^[13].

Inkubacje te przeprowadza się na wytrząsarkach orbitalnych i po użyciu przeciwciał wymywa się te niespecyficznie związane odpowiednim buforem z detergentem^[5]. Zbyt intensywnie wymywanie może znacznie obniżać sygnał pochodzący od analizowanego białka; niewystarczające przemywanie może doprowadzić do uzyskania zbyt wysokiego tła^[10].

Detekcja

Przeciwciała mogą być znakowane markerem promieniotwórczym, a następnie obraz można uzyskać metodami autoradiografii. Przeciwciało może być również połączone (sprzęgnięte) z enzymem, dającym barwny produkt^[11]. Najczęściej w technice western blot wykorzystuje się dwa rodzaje przeciwciał, gdzie przeciwciała drugorzędowe są sprzężone z peroksydazą chrzanową, a do uwidocznienia wykorzystuje się zjawisko wzmocnionej chemiluminescencji^[5]. W procesie tym peroksydaza utlenia luminol, powoduje to emisję światła, co można zarejestrować za pomocą kliszy fotograficznej^[14].

• Schematy czynności w technice western blot
• 
  Przygotowanie próbki do elektroforezy SDS
• 
  Elektroforeza SDS-PAGE
• 
  Przeniesienie białek na membranę
• 
  Wiązanie przeciwciał
• 
  Detekcja białek techniką chemiluminescencji

Zastosowanie

Western blot znalazł zastosowanie m.in. w diagnostyce chorób^[15], np. w przypadku wirusowego zapalenia wątroby typu C metodą tą wykrywa się rdzeń wirusa^[16]. Stosowana jest również do diagnozy boreliozy i gruźlicy^[15]. W diagnostyce zakażenia HIV pozytywny wynik testu western blot przeprowadzany po pozytywnym wyniku testu ELISA daje 99,9% pewności^[17]. Technika western blot jest przydatna w ocenie jakości oczyszczania białka i produkcji rekombinowanych białek po klonowaniu genów^[16].