Termodinâmica dos ácidos nucleicos

A termodinâmica dos ácidos nucleicos é o estudo de como a temperatura afeta a estrutura em dupla hélice dos ácidos nucleicos, fundamentalmente do ADN bicatenário. Quando um ADN bicatenário perde a sua estrutura em dupla hélice e as suas duas fitas se separam, diz-se que ocorreu a desnaturação do ADN. A temperatura de fusão do ADN (ou T_m, do inglês melting temperature) define-se como a temperatura à qual metade da extensão das fitas do ADN perde a sua estrutura habitual em dupla hélice e transiciona para um estado monocatenário ou de enrolamento aleatório. Por tanto, esta "fusão" não significa que o ADN passe para o estado líquido, mas sim que se relaciona com o seu estado bicatenário ou monocatenário. A T_m depende do comprimento da molécula de ADN e da sua sequência específica de nucleótidos; quanto mais longo ou quanto maior o conteúdo GC, mais alta ela é. A desnaturação de um ADN bicatenário (separação das suas duas fitas) devida à temperatura pode ser total ou parcial.

Conceitos

Hibridação

A hibridação de ácidos nucleicos é o processo de estabelecer uma interação específica de sequência não covalente entre duas ou mais fitas de ácido nucleico que apresentam complementaridade de bases, originando um único complexo, que no caso de duas fitas se denomina dúplex de ácido nucleico. Os oligonucleótidos, o ADN, ou o ARN ligam-se ao seu complemento em condições normais espontaneamente, pelo que duas fitas perfeitamente complementares se ligarão uma à outra facilmente. Para reduzir a diversidade e obter os complexos mais preferidos energeticamente, utiliza-se no laboratório uma técnica denominada annealing (ou anelamento, veja-se mais abaixo).

Contudo, devido às diferentes geometrias moleculares dos nucleótidos, uma única inconsistência entre as duas fitas fará com que a ligação entre elas seja energeticamente menos favorável. A medição dos efeitos da incompatibilidade de bases, quantificando a temperatura à qual as duas fitas se ligam (anneal), pode fornecer informação sobre a similaridade na sequência de bases entre as duas fitas que estão a ser hibridadas. Os complexos podem ser dissociados por desnaturação térmica, também chamada fusão. Na ausência de fatores negativos externos, o processo de hibridação e fusão pode repetir-se indefinidamente, o que é a base da técnica da reacção em cadeia da polimerase (PCR). Normalmente, os pares de bases de ácidos nucleicos que se formam são A=T e G≡C, e este último é mais estável.

Desnaturação do ADN

Curva de absorvância durante a desnaturação de um ADN que mostra o efeito hipercrómico.

A desnaturação do ADN, também chamada fusão do ADN, é o processo pelo qual o ADN bicatenário se desenrola e separa em duas fitas monocatenárias devido à rutura das pontes de hidrogénio e das atrações hidrofóbicas entre as bases. A desnaturação ocorre geralmente por causa de um aumento de temperatura (desnaturação térmica), mas pode ocorrer também por efeito de substâncias químicas como a ureia.^[1][2]

Se medirmos a quantidade de luz ultravioleta absorvida (absorvância) durante a desnaturação de um ADN, observa-se que esta aumenta conforme a temperatura aumenta e as fitas do ADN se vão separando. Este efeito chama-se efeito hipercrómico e deve-se a que as interações entre as bases (pontes de hidrogénio), quando estão em forma de dupla hélice, alteram a ressonância dos anéis das bases nitrogenadas, fazendo com que absorvam menos luz, mas quando a dupla hélice se separa, estas restrições desaparecem e absorve-se mais luz.

O processo de desnaturação do ADN pode ser utilizado para analisar alguns aspetos do ADN. Como o emparelhamento de bases guanina-citosina é geralmente mais forte do que o adenosina-timina, a quantidade de guanina e citosina de um ADN, denominada conteúdo GC, pode ser estimada medindo a temperatura à qual o ADN genómico funde.^[3] Temperaturas de fusão mais altas correspondem a conteúdos GC mais altos.

A desnaturação do ADN pode também ser utilizada para detetar diferenças de sequência entre duas sequências de ADN diferentes. O ADN é aquecido e desnaturado até que esteja no seu estado de fitas monocatenárias, e a mistura é arrefecida depois para permitir que as fitas com sequências similares se rehibridem. Formam-se moléculas híbridas entre sequências similares, e as diferenças de sequência originam uma interrupção no emparelhamento de bases. À escala genómica, o método tem sido utilizado para estimar a distância genética entre duas espécies, um processo conhecido como hibridação ADN-ADN.^[4] No contexto de uma única região isolada do ADN, podem ser utilizados géis de gradiente de desnaturação e géis de gradiente de temperatura para detetar a presença de pequenas discordâncias entre as sequências, um processo chamado eletroforese em gel em gradiente de temperatura.^[5][6]

Os métodos de análise do ADN baseados na temperatura de fusão têm a desvantagem de serem aproximações para o estudo das sequências, de modo que a sequenciação de ADN é considerada geralmente como um método mais exato.

O processo de fusão do ADN também é utilizado em técnicas de biologia molecular, especialmente na reacção em cadeia da polimerase. Embora a temperatura de fusão do ADN não seja diagnóstica na técnica, os métodos para estimar a T_m são importantes para determinar quais são as temperaturas mais adequadas para usá-las num protocolo. As temperaturas de fusão do ADN podem também ser utilizadas como uma aproximação para igualar as forças de hibridação de um conjunto de moléculas, por exemplo as sondas de oligonucleótidos das micromatrizes de ADN (DNA microarrays).

Annealing

Em genética, annealing (traduzido às vezes por anelamento, temperagem, hibridação) significa o emparelhamento por formação de pontes de hidrogénio para formar uma dupla hélice entre duas cadeias complementares de ácidos nucleicos, ADN ou ARN. O termo é utilizado muitas vezes para descrever a ligação a uma fita de ADN por emparelhamento de bases de uma sonda de ADN ou de um iniciador ou primer durante a reacção em cadeia da polimerase. O termo também é usado para descrever a reformação (reannealing) da dupla hélice a partir de ADN que foi previamente desnaturado termicamente e separado em fitas complementares. Proteínas como RAD52 ajudam ao annealing do ADN.

Termodinâmica do modelo de dois estados e cálculo de Tm

Utilizam-se várias fórmulas para calcular os valores de T_m.^[7][8] Algumas fórmulas são mais adequadas para prever as temperaturas de fusão de dúplex de ADN.^[9] Para oligonucleótidos de ADN, ou seja, curtas sequências de ADN, a termodinâmica da hibridação pode ser adequadamente descrita como um processo de dois estados. Nesta aproximação, não se leva em conta a possibilidade de existirem estados intermédios de ligação parcial na formação do estado de dupla hélice a partir de oligonucleótidos de fita única. Assumindo isto, podem ser descritos elegantemente os parâmetros termodinâmicos da formação de ácidos nucleicos bicatenários AB a partir de ácidos nucleicos monocatenários A e B.

AB ↔ A + B

A constante de equilíbrio para esta reação é ${\displaystyle K={\frac {[A][B]}{[AB]}}}$. De acordo com a equação de Van't Hoff, a relação entre a energia livre, ΔG, e K é ΔG° = -RTln K, onde R é a constante da lei dos gases perfeitos, e T é a temperatura em kelvins da reação. Isto dá, para o sistema de ácido nucleico,

${\displaystyle \Delta G^{\circ }=-RT\ln {\frac {[A][B]}{[AB]}}}$.

A temperatura de fusão T_m, é a que existe quando metade do ácido nucleico de cadeia dupla está dissociado. Se não estiverem presentes outros ácidos nucleicos, então [A], [B], e [AB] serão iguais, e iguais à metade da concentração inicial de ácido nucleico bicatenário, [AB]_inicial. Isto dá uma expressão para o ponto de fusão de um ácido nucleico dúplex de

${\displaystyle T_{m}=-{\frac {\Delta G^{\circ }}{R\ln {\frac {[AB]_{inicial}}{2}}}}}$.

Como ΔG° = ΔH° -TΔS°, T_m também é dada por

${\displaystyle T_{m}={\frac {\Delta H^{\circ }}{\Delta S^{\circ }-R\ln {\frac {[AB]_{inicial}}{2}}}}}$.

Os termos ΔH° e ΔS° são geralmente dados para a associação das fitas e não para a reação de dissociação (veja abaixo um exemplo no método do vizinho mais próximo). Esta fórmula então se converte em:^[10]

${\displaystyle T_{m}={\frac {\Delta H^{\circ }}{\Delta S^{\circ }+R\ln([A]_{total}-[B]_{total}/2)}}}$, onde [B]_total < [A]_total.

Como já foi dito, esta equação é baseada na suposição de que apenas dois estados estão envolvidos na fusão: o estado de duas fitas em dupla hélice e o estado de enrolamento aleatório de fitas separadas. No entanto, os ácidos nucleicos podem fundir por meio de vários estados intermédios. Para ter em conta este comportamento complicado, devem ser utilizados métodos de mecânica estatística, o que é especialmente importante para sequências longas.

Ver também

• DNA
• desnaturação
• hibridização
• PCR
• Ponto de fusão
• Primer