Subtilisina

A subtilisina é uma enzima protease não específica que foi originalmente obtida a partir do Bacillus subtilis (daí o seu nome), mas as subtilisinas também ocorrem noutras espécies bacterianas.^{[1][2][3][4][5][6]}

Peptidase S8, subtilisin-related
S8 + I9 (lower-right), Bacillus subtilis (PDB 2pmw)
Indicadores
Símbolo	Peptidase_S8
Pfam	PF00082
InterPro	IPR015500
PROSITE	PDOC00125
SCOP	1cse
CDD	cd07477

As subtilisinas pertencem às subtilases, um grupo de serina-proteases que, tal como as restantes serina-proteases, iniciam o ataque nucleofílico à ligação peptídica através de um resíduo de serina localizado no sítio ativo. As subtilisinas têm geralmente pesos moleculares de aproximadamente 20.000 a 45.000 daltons. Podem ser obtidas a partir de certos tipos de bactérias do solo, como o Bacillus amyloliquefaciens, que as segregam em grandes quantidades.

Nomenclatura

Outros nomes dados às subtilisinas são: alcalase, alcalase 0,6L, alcalase 2,5L, enzima ALK, bacilopeptidase A, bacilopeptidase B, bioprase de proteinase alcalina de Bacillus subtilis, bioprase AL 15, bioprase APL 30, colistinase, Subtilisina J, subtilisina S41, subtilisina Sendai, subtilisina GX, subtilisina E, subtilisina BL, genenase I, esperase, maxatase, termose PC 10, protease XXVII, termose, superase, subtilisina DY, subtilopeptidase, SP 266, savinase 8,0L, savinase 4.0T, kazusase, protease VIII, opticlean, proteinase alcalina de Bacillus subtilis, proteína A 3L, savinase, savinase 16.0L, savinase 32.0 L EX, orientase 10B, protease S.

Estrutura

A estrutura da subtilisina foi determinada por cristalografia de raios X. É uma proteína globular de 275 resíduos com várias hélices alfa e uma grande folha beta. Estruturalmente, não tem qualquer relação com o clã quimotripsina das serina-proteases, mas utiliza o mesmo tipo de tríade catalítica no seu sítio ativo. Este é um exemplo clássico de evolução convergente.

Mecanismo de catálise

O sítio ativo apresenta uma rede de retransmissão de carga envolvendo os resíduos do sítio ativo Asp-32, His-64 e Ser-221, dispostos numa tríade catalítica. A rede de retransmissão de carga funciona da seguinte forma: a cadeia lateral carboxilato da Asp-32 forma ligações de hidrogénio com o protão ligado ao azoto do anel imidazol da His-64. Isto é possível porque a Asp é carregada negativamente em pH fisiológico. O outro azoto da His-64 forma ligações de hidrogénio com o protão do O-H da Ser-221. Esta última interação resulta numa separação de carga O-H, e o átomo de oxigénio torna-se mais nucleofílico. Isto permite que o átomo de oxigénio da Ser-221 ataque os substratos de entrada (i.e., quebre as ligações peptídicas dos peptídeos de entrada), auxiliado pela cadeia lateral carboxamida vizinha da Asn-155.

Embora os resíduos Asp-32, His-64 e Ser-221 estejam distantes na sequência proteica, estão próximos no sítio ativo quando a proteína dobra.

Para resumir as interações descritas acima, a Ser-221 atua como um nucleófilo e cliva a ligação peptídica com o seu átomo de oxigénio parcialmente negativo. Isto é possível devido à natureza de alívio de carga do sítio ativo da subtilisina.

Aplicações

Ferramenta de laboratório

Em biologia molecular, quando a bactéria B. subtilis, o gene que codifica a subtilisina (aprE) é frequentemente o segundo gene mais utilizado, a seguir ao gene amyE, para a produção de construções de repórteres integrados, devido à sua dispensabilidade.

Comercial

As subtilisinas geneticamente modificadas são muito utilizadas em produtos comerciais (a enzima nativa é facilmente inativada por detergentes e altas temperaturas) para a lavagem de roupa.^[7] detergentes para a máquina de lavar louça, cosméticos, processamento de alimentos,^[8] pomadas para o cuidado da pele,^[9] limpeza de lentes de contacto e investigação em química orgânica de síntese.

Referências

1. Ottesen Mm, Svendsen I (1970). «The subtilisins». Methods Enzymol. 19: 199-215. doi:10.1016/0076-6879(70)19014-8
2. Markland FS, Smith EL (1971). Boyer PD, ed. «The Enzymes» 3rd ed. New York: Academic Press. 3: 561-608 |capítulo= ignorado (ajuda)
3. Philipp M, Bender ML (1983). «Kinetics of subtilisin and thiolsubtilisin». Mol. Cell. Biochem. 51 (1): 5–32. PMID 6343835. doi:10.1007/bf00215583
4. Nedkov P, Oberthür W, Braunitzer G (abril de 1985). «Determination of the complete amino-acid sequence of subtilisin DY and its comparison with the primary structures of the subtilisins BPN', Carlsberg and amylosacchariticus». Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 366 (4): 421–30. PMID 3927935. doi:10.1515/bchm3.1985.366.1.421 !CS1 manut: Nomes múltiplos: lista de autores (link)
5. Ikemura H, Takagi H, Inouye M (junho de 1987). «Requirement of pro-sequence for the production of active subtilisin E in Escherichia coli». J. Biol. Chem. 262 (16): 7859–64. PMID 3108260 !CS1 manut: Nomes múltiplos: lista de autores (link)
6. Polgár L (1987). «Structure and function of serine proteases». In: Brocklehurst K, Neuberger A. Hydrolytic enzymes. Amsterdam: Elsevier. ISBN 0-444-80886-8
7. Spar Washing Detergent contents http://www.5010358128009.detergent-info.com/ Arquivado em 2020-09-23 no Wayback Machine
8. «Copia arquivada». Consultado em 24 de setembro de 2014. Arquivado do original em 26 de setembro de 2008
9. «Copia arquivada». Consultado em 24 de setembro de 2014. Arquivado do original em 3 de fevereiro de 2008