Точка начала репликации

Точка начала репликации (ориджин репликации, англ. origin of replication) — это фрагмент молекулы нуклеиновой кислоты, с которого начинается её репликация^[1]. Структура точки начала репликации (нуклеотидная последовательность) отличается у разных видов, но у всех организмов это АТ-богатая и потому легкоплавкая последовательность. Точка начала репликации и прилегающие к ней фрагменты нуклеиновой кислоты, не отделённые сайтами терминации, составляют единицу репликации — репликон. Репликация ДНК может начинаться от точки начала репликации в одном или двух направлениях^[2].

Хромосомы и плазмиды прокариот содержат одну, реже несколько точек начала репликации ДНК; хромосомы эукариот имеют множество таких точек^[2]. Также точки начала репликации РНК обнаружены у РНК-содержащих вирусов, например, у вирусов, содержащих двуцепочечные РНК.

До начала репликации с точкой начала репликации обычно связывается пререпликационный комплекс.

Количество точек начала репликации в геноме

• Геном вироидов содержит единственную молекулу РНК и, как правило, по две точки начала репликации.
• Геном бактерий чаще всего представлен единственной молекулой ДНК (хромосомой) с единственной точкой начала репликации^[3].
• Геном архей, как правило, состоит из единственной кольцевой хромосомы, которая может нести от одной до четырёх точек начала репликации^[4][5].
• Геномы эукариот как правило содержат множество точек начала репликации в каждой хромосоме — до ста тысяч в одной клетке человека^[6]. Большое количество точек начала репликации помогает ускорить процесс удвоения значительно большего, относительно прокариот, генетического материала. У дрожжей точку начала репликации называют ARS.

Названия генетических локусов, включающих точки начала репликации, обычно содержат буквосочетание ori. В процессе конъюгации репликация по типу катящегося колеса начинается на последовательности oriT F-плазмиды. Митохондриальная ДНК многих организмов содержит две последовательности ori. У человека они называются oriH и oriL для тяжелой и легкой цепи ДНК, соответственно.

Структура точек начала репликации

OriC Escherichia coli

Генетический локус, содержащий единственную точку начала репликации хромосомы Escherichia coli (кишечной палочки), получил название oriC. OriC состоит из 245 пар оснований и включает две функциональных области: область специфичного связывания фактора инициации репликации DnaA^[англ.] и область первичного раскручивания спирали ДНК — DUE (англ. DNA unwinding element)^[2][7][8].

Область связывания DnaA

Область связывания DnaA содержит многочисленные 9-членные повторы, которые служат местами посадки DnaA^[англ.] на ДНК. Среди таких повторов выделяют DnaA-боксы, I-сайты и τ-сайты. DnaA-боксы — это фрагменты ДНК с консенсусной последовательностью 5'-TTATNCACA-3'. OriC содержит 5 DnaA-боксов, которые обозначают как R1—R5. Эти боксы отличаются по аффинности к DnaA: R1 и R4 обладают наибольшим сродством к DnaA (K_d=3—9 наномоль) и располагаются по краям области связывания DnaA в oriC. Аффинность DnaA-боксов к DnaA уменьшается в ряду R1=R4>R2>R3=R5^[8].

I-сайты — 9-членные участки ДНК, которые отличаются от консенсусной последовательности DnaA-бокса на 3—4 нуклеотида. τ-сайты — 6-членные последовательности вида 5'-TGATCC-3'. OriC содержит 3 I-сайта и 2 τ-сайта^[8].

DnaA является АТФазой и может существовать в свободном, АТФ- или АДФ-связанном состоянии. R1 и R4 связывают DnaA независимо от его состояния. R2 обладает средней аффинностью к DnaA (по сравнению с R1 и R4), R3, R5 и все I- и τ-сайты — относительно низкой и связывают этот белок преимущественно в АТФ-связанном состоянии^[8]. На протяжении большей части клеточного цикла DnaA связан только с тремя наиболее аффинными сайтами: R1, R2 и R4. К остальным он присоединяется только непосредственно перед инициацией репликации в АТФ-связанном состоянии^[7].

Между сайтов связывания DnaA находится по одной области узнавания для гистоноподобных белков E. coli IHF и Fis. Связываясь с ДНК, эти белки изгибают её. IHF присоединяется к oriC незадолго до начала репликации, он стимулирует посадку DnaA на низкоаффинные сайты и инициацию репликации. Предполагают, что белок Fis участвует в координации инициации репликации и клеточного цикла, а также обеспечивает синхронную инициацию на нескольких oriC в быстро делящихся клетках. Известно, что связывание Fis с oriC временно ингибируется непосредственно перед инициацией^[8].

Область первичного раскручивания спирали ДНК

Область первичного раскручивания спирали ДНК включает три AT-богатых тринадцатичленных повтора 5'-GATCTNTTNTTTT-3'. DnaA в комплексе с АТФ связывается в этой областью перед инициацией. Связывание DnaA и других белков с oriC, предположительно, вызывает локальное торсионное напряжение в ДНК, которое совместно с отрицательной сверхспирализацией способствует расхождению двух цепей ДНК в области тринадцатичленных повторов. Все три повтора должны быть задействованы для инициации репликации^[8].

Сайты метилирования

OriC содержит 11 палиндромных сайтов метилирования 5'-GATC-3'. Метилирование осуществляется ферментом ДНК-аденинметилтрансферазой (Dam) по N⁶-положению аденина в обеих цепях ДНК. Некоторые из сайтов метилирования перекрываются с участками связывания DnaA. Для инициации репликации необходимо метилирование обеих цепей ДНК. Репликация области oriC приводит к появлению полуметилированных точек начала репликации: дочерняя цепь ДНК остаётся неметилированной в области oriC около 13 минут в отличие от других сайтов 5'-GATC-3' в геноме, которые метилируются в течение полутора минут после репликации. Полуметилированная точка инициации репликации неактивна, таким образом задержка метилирования предотвращает слишком скорую повторную инициацию^[2][8].