Cas9

Cas9 (англ. CRISPR associated protein 9, CRISPR-ассоциированный белок) — это управляемая при помощи РНК-гидов эндонуклеаза, связанная с адаптивной иммунной системой CRISPR (англ. Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats) у ряда бактерий, в частности Streptococcus pyogenes. S. pyogenes использует Cas9 для запоминания^[1], последующей проверки и разрезания чужеродной ДНК^[2], например, ДНК бактериофагов или плазмид.

Кристаллическая структура S. aureus Cas9 в комплексе с сгРНК и её целевой ДНК в разрешении 2.6 A˚. (Nishimasu, et al. 2015)

CRISPR/Cas9. Фиолетовым выделен участок гидовой РНК (gRNA) узнающий комплементарный участок-мишень на ДНК (выделен синим). PAM (выделен красным).

Cas9 выполняет проверку посредством раскручивания инородной ДНК и определения её комплементарности с двадцатью спаренными основаниями спейсера управляющей РНК. Если субстрат комплементарен управляющей РНК, Cas9 расщепляет чужую ДНК. В этом смысле механизм CRISPR-Cas9 имеет ряд параллелей с механизмом РНК-интерференции (RNAi) у эукариот. Безопасность практического применения данного метода определяется в том числе и тем фактом, является ли искомая последовательность двадцати спаренных оснований уникальной в модифицируемой ДНК.

Использование Cas9 в генной инженерии

Механизм избирательного ингибирования транскрипции с помощью dCas9 путём стерического препятствия

Варианты Cas9, которые связываются с ДНК, но не расщепляют её могут быть использованы для создания искусственных факторов транскрипции для избирательного регулирования транскрипционной активации и репрессии

Кроме изначальной функции в бактериальном иммунитете, белок Cas9 активно используют для создания точечных разрывов в двойной спирали ДНК, такие разрывы могут приводить к инактивации генов или созданию гетерологичных генов посредством соединения негомологичных концов и соответствующей гомологичной рекомбинации. Вместе с белками ZFN и TALEN, Cas9 становится значимым инструментом редактирования генома.^[3]

Одним из первых продемонстрировал программируемое расщепление ДНК белком Cas9 литовский биохимик Виргиниюс Шикшнис, но его статья не была принята на рассмотрение журналом Cell Reports^[англ.] 18 апреля 2012 года. Месяц спустя он отправил её в PNAS где на рассмотрение и публикацию ушло несколько месяцев^[4]. Тем временем американский биохимик Дженнифер Даудна и французский микробиолог Эмманюэль Шарпантье опубликовали свою статью в рецензируемый научный журнал Science, где она была рассмотрена и принята в течение двух недель^[4].

За создание новых технологий, позволяющих проводить с помощью CRISPR-Cas9 редактирование генома Эмманюэль Шарпантье и Дженнифер Даудна получили Нобелевскую премию по химии 2020 года.^[5]

Вызывает удивление тот факт, что из-за патентных ограничений технология редактирования с помощью Cas9 доступна не ученым всего мира, а только владельцам патента, что является препятствием прогрессу науки, разработке лекарств для людей, живущих с серьёзными заболеваниями^[6].

К 2012 году Cas9 приобрёл популярность, потому что он позволяет расщеплять практически любую нуклеотидную последовательность, комплементарную управляющей РНК^[2]. Поскольку избирательность Cas9 является следствием комплементарности управляющей РНК и ДНК, а не модификации самого белка (в отличие от случаев TALEN и ZFN), для новых ДНК-мишеней возможна выработка специфических Cas9^[7]. Варианты Cas9, которые связывают ДНК, но не расщепляют её (dCas9), могут быть использованы для доставки транскрипционных активаторов или репрессоров к специфичным последовательностям ДНК с целью регулирования транскрипционной активации и репрессии^[8][9]. Хотя природный Cas9 требует составления управляющей РНК из двух в корне различных РНК — CRISPR-РНК (crRNA), и транс-активационную РНК (tracrRNA)^[2], нацеливание Cas9 было упрощено при помощи выработки единой химерной управляющей РНК. Предполагается, что Cas9 можно будет использовать для изменения генома целых популяций организмов^[10]. В 2015 году посредством Cas9 впервые был модифицирован геном человеческого эмбриона^[11]. Разработана технология иммуногеномной инженерии гибридом, позволяющая быстро перепрограммировать специфичность их антител с помощью Cas9^[12].

Создана технология, которая позволяет редактировать отдельные «буквы» ДНК и РНК, не разрезая цепь ДНК, а путём преобразования одного нуклеотидного основания в другое^[13], что позволит лечить врожденные заболевания, вызванные точечными мутациями.^[14][15][16]

Используя цитидин-деаминазы или же аденозин-деаминазы соединённые с dCas9 можно выключить экспрессию (путём введения преждевременных стоп-кодонов^[17]) или поменять сплайсинг необходимые для синтеза тех или иных белков^[18][19]

Создана технология MAGESTIC (multiplexed accurate genome editing with short, trackable, integrated cellular barcodes), которая не только расщепляет ДНК, но ещё и доставляет к месту разрыва кусок ДНК необходимый для точной замены (с помощью гибридного связывающего ДНК белка LexA-Fkh1p), что повышает точность и эффективность редактирования^[20][21]. Ещё одним инструментом для целевой вставки ДНК может стать CRISPR-ассоциированная транспозаза CAST (CRISPR-associated transposase) цианобактерии Scytonema hofmanni. ShCAST катализирует РНК-управляемую транспозицию ДНК путем однонаправленной вставки ниже протоспейсера сегментов ДНК размером в 60-66 пар нуклеотидов ^[22].

Использование dCas9

Соединив инактивированную молекулу dCas9, которая связывает ДНК, но не расщепляет её, с нуклеазой FokI, удаётся получить нуклеазы и рестриктазы для высокоселективного разрезания ДНК^[23][24][25]. Разработан также способ избирательного эпигенетического перепрограммирования активности генов с помощью инактивированной молекулы dCas9, соединённой с ферментом, осуществляющим деметилирование ДНК^[26]. Причём такое перепрограммирование эпигенома можно проводить даже in vivo^[27][28]. Позднее выяснилось, что если укоротить управляющую РНК до 14-15 нуклеотидов, то молекула Cas9 теряет способность разрезать ДНК^[29][30]. Используя это свойство удалось создать систему для избирательной активации определённых генов in vivo и проверить её эффективность путём лечения мышей со смоделированными заболеваниями^[31]. У этого метода есть только одна проблема: обычно система CRISPR загружается в безвредный вирус, называемый аденоассоциированным вирусом (AAV), который переносит систему в клетку. Но весь белок, состоящий из dCas9 и направляющей РНК, слишком велик, чтобы поместиться в один AAV. Чтобы обойти эту проблему, исследователи загрузили dCas9 в один вирус, а управляющую РНК — в другой^[31]. Созданы трансгенные линии мышей для направленной регуляции генов in vivo путем редактирования эпигенома с помощью систем dCas9p300 и dCas9KRAB. Эти линии мышей являются удобными инструментами для манипулирования экспрессией генов in vivo с помощью различных направляющих РНК.^[32]

Использование системы Suntag позволяет нескольким антителам, слитым с активатором транскрипции VP64, связываться с dCas9-Suntag. Это, в свою очередь, задействует РНК-полимеразу и увеличивает экспрессию генов. смотри также рис 1 в ссылке^[33]

Повысить эффективность молекулы dCas9 позволяет повторяющийся полипептидный массив из повторяющихся антигенов, называемый SunTag, который может привлекать несколько копий антител, связанных с ферментом, осуществляющим эпигенетическое редактирование, или же с носителем флуоресцентной метки.^[33][34]

Ещё одно применение dCas9 это программируемая модификация аминокислот в белках хроматина. Например искусственная гистон-протеинкиназа dCas9-dMSK1 позволяет осуществить гиперфосфорилирование серина 28 в гистоне H3 (H3S28ph), играющего роль "пусковой кнопки" в избирательной активации промоторов, и таким образом, повысить экспрессию выбранных генов.^[35][36]

Новые способы доставки Cas9 в клетку

Основными требованиями к системе доставки Cas9 помимо высокой эффективности доставки является: (1) конструкция синтезирующая Cas9 не должна встраиваться в геном клетки и не должна быть в клетке постоянно чтобы не мешать работе клетки и не спровоцировать иммунных реакций; (2) средство доставки должно быть способно вместить достаточно большие по размерам фермент Cas9 или кодирующую его мРНК, а также одну или несколько направляющих РНК; (3) оно должно быть удобно для использования в виде инъекций; (4) такое средство вместе с Cas9 и направляющими РНК должно быть достаточно легко воспроизводимым для крупномасштабного производства лекарственного препарата для борьбы с распространенными болезнями. Таким критериям в отличие от вирусных систем доставки, отвечают липидные наночастицы.^[37][38] Так, например, была создана биодеградируемая система доставки Cas9 липидной наночастицей, которая позволила после однократного введения достичь in vivo более 97 % ингибирования уровня одного из белков сыворотки крови. При этом такое однократное введение, несмотря на временный характер системы доставки и компонентов системы редактирования, приводило к долговременному ингибированию продолжавшемуся в течение 12 месяцев^[39]. Для доставки используют также внеклеточные везикулы^[40]

Тем не менее продолжается разработка вирусных частиц для доставки Cas9 и sgРНК. Одной из таких разработок является NanoMEDIC (nanomembrane-derived extracellular vesicles for the delivery of macromolecular cargo)^[41] NanoMEDIC эффективно индуцировал редактирование генома в различных типах клеток человека, таких как Т-клетки, моноциты, ИПСК, корковые нейроны, полученные из ИПСК, и миогенные клетки.

Поскольку существующие методы введения систем CRISPR-Cas в клетки с использованием вирусов-носителей и электрических импульсов, недостаточно эффективны для клеток, взятых непосредственно у пациентов (так называемых первичных клеток), предложено использовать комбинацию двух модифицированных пептидов, (одного из вируса ВИЧ и одного из вируса гриппа) облегчающую проникновение молекул CRISPR-Cas9 и Cas12a через внешнюю мембрану первичных клеток и в ядра, где находится большая часть клеточной ДНК. Это позволило сократить время инкубации и повысило эффективность редактирования генов до 98%^[42]. Метод назван PAGE (Peptide-Assisted Genome Editing).

Легче переносить в клетки для редактирования генома более компактные белки Cas, поскольку они могут быть упакованы в небольшие по объёму средства доставки, такие как дезактивированный аденоассоциированный вирус (AAV). В качестве таких компактных белков можно использовать варианты Cas, обнаруженные в бактериофагах, например CRISPR-CasΦ, который вдвое меньше по молекулярной массе по сравнению с Cas9^[43] или генноинженерный CasMINI, который несмотря на малые размеры, на клетках млекопитающих оказался столь же эффективен как и обычный Cas, и при этом лучше проникает в клетки^[44]

Модификация Cas9

Модификация Cas9 путем её слияния с хроматин-модулирующими пептидами, полученными из белков группы высокой подвижности HMGN1 и HMGB1, гистона H1 и комплексов ремоделирования хроматина, повышает её активность в несколько раз, особенно в отношении рефрактерных для неё участков хроматина. Эта стратегия слияния, называемая CRISPR-хром (англ. CRISPR-chrom), может быть использована для улучшения эффективности работы нуклеаз Cas9 при модификации генома^[45].

Комплекс pegРНК с гибридным белком nCas9 (H840A) – обратная транскриптаза (RT), редактирующая с праймером

Механика праймер опосредованного редактирования с Cas9 по Anzalone et al. (2019)^[46] в модификации Geurts et al. (2021)^[47]

CRISPR/Cas9 редактирование с праймером

dCas9-RT редактирование с праймером — в этом методе используется нуклеаза Cas9 (модифицированная в никазу, так что она может создавать разрыв только в одной цепи ДНК) соединённая с обратной транскриптазой (RT) и вместо обычной направляющей РНК используется так называемая pegРНК (prime editing guid RNA — с праймером редактирующая гид РНК). Этот метод, по мнению авторов, является более точным и универсальным, чем все разработанные до сих пор альтернативы CRISPR ^{[46][47][48][49]}.

Модульная платформа SSSavi на основе dCas9 для комбинаторного редактирования эпигенома

Cистема SSSavi представляет собой сменную и реконфигурируемую стыковочную платформу, объединённую с dCas9, что позволяет одновременно задействовать до четырёх различных эффекторов, обеспечивая точный контроль состава эффекторов и их пространственного порядка. Пространственное предетерминированное упорядочение используемых эффекторов позволит более точно осуществлять регуляцию транскрипции.^[50]

Использование dCas9 для визуализации геномных последовательностей in situ

Исследователи разработали новый метод молекулярной визуализации с помощью РНК-направляемой эндонуклеазы CRISPR/dCas9 связанной с меткой. Технология позволила метить выбранные геномные последовательности в ядрах и хромосомах in situ. Метод назван RGEN-ISL. В отличие от классической флуоресцентной гибридизации in situ, RGEN-ISL не требует денатурации ДНК и, следовательно, обеспечивает лучшую сохранность структуры хроматина^[51]. Аналогичную функцию выполняет генетический инструмент, названный CRISPR-HOT (CRISPR–Cas9-mediated homology-independent organoid transgenesis), для цветной маркировки определённых генов в органоидах человека^[52][53][54].

CARTRIDGE

CARTRIDGE (Cas-Responsive Translational Regulation Integratable into Diverse Gene control) технология использует белки Cas в качестве репрессоров и активаторов трансляции в клетках млекопитающих.^[55]

Эндонуклеазы, аналогичные Cas9

Cas12a

В отличие от Cas9 которая разрезает обе нити молекулы ДНК в одном и том же месте, оставляя тупые концы, Cas12a оставляет одну нить длиннее другой, создавая липкие концы длиной 4-5 нуклеотидов, что повышает эффективность генетических вставок и их специфичность.

Fanzor

Fanzor это программируемая РНК-управляемая эндонуклеаза эукариот — организмов, включающих грибы, растения и животных. В отличие от белков CRISPR, ферменты эндонуклеазы Fanzor кодируются в эукариотическом геноме в составе мобильных элементов.^[56][57].

См. также

• CRISPR
• Искусственные рестриктазы
• Домен белка
• Искусственные факторы транскрипции
• Генетическая инженерия
• Трансдифференцировка с помощью CRISPR-опосредованного активатора
• Epigenome editing
• CRISPR/Cas Tools
• dCas9 activation system
• CRISPR interference
• CRISPR-Display