Замкнутая нуклеиновая кислота

Замкнутая нуклеиновая кислота (англ. locked nucleic acid, LNA), также известная как мостиковая нуклеиновая кислота (BNA)^[1] и часто называемая недоступной РНК, представляет собой модифицированный нуклеотид РНК, в котором фрагмент рибозы модифицирован дополнительным мостиком, соединяющим 2'-кислородную группу. и 4' углерод. Мостик «запирает» рибозу в 3'- эндо (северной) конформации, которая часто встречается в дуплексах А-формы. Эта структура обеспечивает повышенную устойчивость к ферментативному расщеплению^[2][3][4][5]. LNA также предлагает повышенную специфичность и аффинность при спаривании оснований в качестве мономера или компонента олигонуклеотида^[6]. Нуклеотиды LNA могут быть смешаны с остатками ДНК или РНК в олигонуклеотиде.

Химическая структура мономера LNA: дополнительный мостик связывает 2'-кислород и 4'-углерод пентозы.

Синтез

Обика и др. были первыми, кто химически синтезировал LNA в 1997 году^[7], а в 1998 году независимо друг от друга последовала группа Джеспера Венгеля^[8]. Это стало возможным после того, как Замечник и Стивенсон в 1978 году заложили основу для возможности того, что олигонуклеотиды могут быть отличными агентами для контроля экспрессии генов^[9]. На сегодняшний день было показано, что два разных подхода, называемые соответственно линейной и конвергентной стратегиями, обеспечивают высокую производительность и эффективность LNA. Линейная стратегия синтеза была впервые подробно описана в работах Обика и др.^[7] В этом подходе в качестве исходного материала можно использовать уридин (или любой доступный нуклеозид РНК). Конвергентная стратегия требует синтеза промежуточного сахара, который служит донором гликозила, необходимым для связывания с азотистыми основаниями. Обычно D-глюкоза используется для получения промежуточного сахара, который впоследствии реагирует с азотистыми основаниями с использованием модифицированной процедуры Форбрюгена, позволяющей стереоселективное связывание^[10].

Добавление различных фрагментов остается возможным при сохранении ключевых физико-химических свойств, таких как высокое сродство и специфичность, очевидные в первоначально синтезированном LNA^[11]. Такие олигомеры синтезируются химическим путем и коммерчески доступны.

Включение в ДНК/РНК

LNA может быть включен в ДНК и РНК с помощью неразборчивости определённых ДНК- и РНК-полимераз. ДНК-полимераза Phusion, коммерчески разработанный фермент, основанный на ДНК-полимеразе Pfu, эффективно включает LNA в ДНК^[12].

Характеристики

LNA обеспечивает повышенную биостабильность по сравнению с биологическими нуклеиновыми кислотами. Олигонуклеотиды, модифицированные LNA, продемонстрировали улучшенную термодинамику при гибридизации с РНК, одноцепочечной ДНК и двуцепочечной ДНК^[13].

Применение

LNAзимы

ДНКзимы могут быть модифицированы для включения остатков LNA с образованием LNAзимов (LNA-модифицированных ДНКзимов). Эти модифицированные олигонуклеотиды, как и их родственные ДНКзимы, обычно представляют собой эндонуклеазы, которые связываются со специфическими целевыми последовательностями РНК и расщепляют фосфодиэфирную связь, существующую между нуклеотидами^[14]. Однако они демонстрируют более эффективное расщепление фосфодиэфирных связей по сравнению с их немодифицированными аналогами^[15]. Модификация плеч распознавания субстрата ДНКзимов мономерами LNA дает LNAзим, который распознает вирус Коксаки A21 (CAV-21) и расщепляет его целевую последовательность РНК, аналогичную последовательности в 5'-нетранслируемой области (5’UTR) риновируса человека −14 (ВСР-14); последовательность, не распознаваемая немодифицированными ДНКзимами^[16].

Терапия

Терапевтическое использование олигонуклеотидов на основе LNA является новой областью биотехнологии^[17]. Различные олигонуклеотиды LNA были оценены на предмет их фармакокинетических профилей и профилей токсичности. Исследования пришли к выводу, что токсичность LNA обычно не зависит от последовательности олигонуклеотидов и демонстрирует предпочтительный профиль безопасности для переводимых терапевтических применений^[11].

LNA был исследован на предмет его терапевтических свойств при лечении рака и инфекционных заболеваний. Заблокированная антисмысловая молекула фосфоротиоата нуклеиновой кислоты, названная SPC2996, была разработана для нацеливания на мРНК, кодирующую онкобелок Bcl-2, белок, который ингибирует апоптоз в клетках хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ). Клинические испытания фазы I и II продемонстрировали дозозависимое снижение циркулирующих клеток ХЛЛ примерно у 30 % выборки, что предполагает дальнейшее изучение SPC2996^[18].

LNA также был применен к Miravirsen, экспериментальному терапевтическому средству, предназначенному для лечения гепатита C, представляющему собой 15-нуклеотидную фосфоротиоатную последовательность со специфичностью связывания с MiR-122 (миРНК, экспрессируемая в гепатоцитах)^[19][20].

Обнаружение и диагностика

Аллель-специфическая ПЦР с использованием LNA позволяет создавать более короткие праймеры без ущерба для специфичности связывания^[21].

LNA был включен в флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH)^[22]. FISH — это распространенный метод, используемый для визуализации генетического материала в различных клетках, но исследования показали, что этот метод был ограничен низкой эффективностью гибридизации зондов. Наоборот, зонды с включением LNA продемонстрировали повышенную эффективность гибридизации как в ДНК, так и в РНК . Улучшенная эффективность FISH с включением LNA привела к FISH-анализу хромосом человека, нескольких типов нечеловеческих клеток и микрочипов^[22].

Также были проведены анализы генотипирования LNA, специально для обнаружения мутации в аполипопротеине B^[23].

Из-за его высокой способности к различению несоответствий LNA был изучен на предмет его применения в диагностических инструментах. Иммобилизованные зонды LNA были введены в мультиплексный анализ генотипирования SNP^[24].

Редактирование генов

LNA-модифицированные ssODN (синтетические одноцепочечные олигонуклеотиды ДНК) можно использовать, как и обычные ssODN, для редактирования генов с одним основанием. Использование LNA в предполагаемом месте модификации или рядом с ним позволяет избежать репарации несоответствия ДНК из-за более высокой термодинамической стабильности, которой он обладает^[25].