கணிமி

யோசுவா லீடர்பெர்க் (Yoshuva Leaderberg) என்னும் அமெரிக்க மூலக்கூற்று உயிரியலாளர் கணிமி (Plasmid, பிளாசுமிடு) என்ற சொல்லை முதன் முதலில் 1952 இல் ஆய்வு முறைக்கு அறிமுகப்படுத்தினார். கணிமி என்பது ஒரு கூடுதலான நிறப்புரி ஆகும். இவை பொதுவாக வட்ட வளைய வடிவமுடன் ஈரிழை கொண்டவையாக இருக்கும். நிலைக்கருவற்ற உயிரிகளில் நிறைந்து காணப்படும். பின்னாளில் நிலைக்கரு உயிரினமான ஓர் உயரணு இயீசுட்டில் (yeast) 2 மைக்ரோன் (2 micron) கணிமி கண்டுபிடிக்கப்பட்டது. இவை தாம் சார்ந்துள்ள உயிரினத்தின் நிறப்புரியைச் சாரமால் தன்னிச்சையாக பல்கிப் பெருகும் தன்மையை உடையவை.

வட்ட வளைய வடிவில் காணப்படும் கணிமியைக் காட்டும் படம். இவை நிறப்புரியைச் சாராமல் தனியாக பல்கிப் பெருகும் தன்மையைக் கொண்டுள்ளன.

கணிமிகள் குழலிணைவு (conjugation) என்னும் நிகழ்வு மூலம் ஒரு உயிரணுவில் இருந்து மற்றொன்றுக்கு கடத்தப்படுகின்றன. இவ்வாறு இன உயிரணுக்கள் இல்லாமல் அல்லது பாலுறவு இல்லாமல் மரபணு கடத்தப்படும் நிகழ்வுக்கு பாலுறவு சாரா மரபணு கடத்தல் (horizontal gene transfer) எனப்பெயர். கணிமிகள் தாம் இருக்கும் உயிரினத்துக்கு ஓர் எதிப்புத் தன்மையை அல்லது குழலிணைவு என்னும் நிகழ்வுக்கு உதவி புரிபவையாக இருக்கின்றன.^[1][2][3]

வகைப்பாட்டியல்:

இதனின் வகைப்பாட்டியலை இவ்விணையத் பரணிடப்பட்டது 2009-02-01 at the வந்தவழி இயந்திரம் தளத்தில் காணலாம்.

பரப்பிகள்:

கணிமிகள், மரபு தொழில்நுட்பத்தில் அல்லது உயிர் தொழில்நுட்பத்தில் பரப்பிகள் என அழைக்கப்படும். இவைகளைக் கொண்டு ஒரு மரபணுவை பயிரிலோ அல்லது விலங்குகளிலோ வெளிப்படுத்தலாம். மேலும் நாம் விரும்பும் புரதத்தை மிகைபடுத்தலாம்.

மேலும்

1. புரதங்களுக்கு இடையேயான இணைவாக்கம் பற்றி அறிய
2. கணிக்கும் மரபணு வை பக்டிரியல் படிவாக்கம் செய்வதற்கு
3. மரபணு தொடரிகள் பற்றி அறிய

மேலும் பரப்பிகளை பாவித்து பயிர்நோய்க் கோலுயிரி உட்செலுத்தல் மற்றும் தற்காலிக மரபணு வெளிப்படுதல் என்னும் நுட்பம் மூலம் புரத அளவுகளை மிகைப்படுத்த என பல்வேறு ஆய்வுகளில் பரப்பிகள் அல்லது கணிமிகள் பயன்படுகின்றன.

வகைகள்:

கணிமிகளை தான் இருக்கும் உயிரினத்துக்கு கொடுக்கும் நன்மை கொண்டு பல வகையாகப் பிரிக்கலாம்.

குழலிணைவு விவரிக்கும் படம்

வழமையான அல்லது செழிப்பு கணிமிகள் (Fertility or F-Plasmid) :

இவைகள் குழலிணைவு என்னும் நிகழ்வு மூலம் ஒரு செல்லில் இருந்து மற்ற உயிரணுக்களுக்கு கணிமிகளை மாற்றும் தன்மை கொண்டவை.

எதிர்ப்பு கணிமிகள் (R or Resistance plasmid):

இவைகள் தான் சார்ந்த உயிரினத்துக்கு மருந்துகளை அல்லது நஞ்சுகளை எதிர்த்து வாழும் தன்மை கொடுக்கும்.

கோல்-கணிமிகள் (Col-Plasmid):

இவைகள் சில வகையான நஞ்சு பொருள்களை உற்பத்தி செய்யும் தன்மை கொண்டுள்ளதால் மற்ற உயிரிகளை கொல்லும் தன்மையைக் கொடுக்க வல்லன.

மக்கும் கணிமிகள்: (Degradative plasmid)

இவைகள் சில அழிக்க முடியாத வேதிப் பொருள்களை மக்கும் தன்மை அல்லது சூழலுக்கு உகந்தவையாக மாற்றும் தன்மை கொடுக்கின்றன. எ.கா. Toluene or Salicylic acid

வீரிய கணிமிகள்: Virulence Plasmid

இவைகள் பக்டீரியாவுக்கு நோய் தூண்டும் தன்மை கொடுக்கின்றன.

மேலும் சில கணிமிகள் நைட்ரசென் நிலைப்படுத்தும் (Nitrogen fixation) தன்மையை சில பக்டீரியாவிற்கு அளிக்கின்றன.

கணிமி பிரித்தெடுத்தல்:

மூலக்கூற்று உயிரியலில் கணிமி பிரித்தெடுத்தல் (plasmid extraction) என்னும் முறை இன்றியமையாத ஒன்றாகும். கணிமியை அல்லது பரப்பியை பிரித்தெடுக்க பல்வேறு முறைகளும், தற்காலத்தில் கிட் (kit) என்னும் தனியார் நிறுவனத்தாரின் ஆயத்த பொருள்களும் பாவிக்கப்படுகின்றன. ஏறக்குறைய அனைத்து ஆயத்த பொருள்களும் டோல்லி மற்றும் பெல்போயின் முறையைப் பின்பற்றி கணிமியை அல்லது பரப்பியை ஈ.கோலியில் இருந்து பிரிக்க பயன்படுகிறது.

பரப்பியல்லாத கணிமியை பண்படுத்தப்படாத கணிமி அல்லது க்ரிப்டிக் (cryptic) கணிமி எனலாம். பின்னாளில் இவ்வகை பண்படுத்தப்படாத கணிமிகளில் பல்வேறு மாற்றங்கள் செய்யப்பட்டு, எ. கா. பல் படிவாக்க இடம் (Multiple cloning site), தேர்ந்தெடுக்கும் முகவரை (selectable marker) எதிர்த்து வாழும் தன்மை என பல பகுதிகள் இணைக்கப்பட்டு, பயன்பாட்டுக்கு உள்ள பரப்பி உருவாக்கப்பட்டது.

கணிமி பிரித்தெடுக்கும் முறையில் பின்வரும் நிலைகள் மிக முக்கியமாகும்.

௧. செல்களை உடைத்தல்

௨. கணிமியை நிறப்புரி மாசு இல்லாமல் பிரித்தல்

௩. புரதம் மற்றும் ஆர்.என்.ஏ மாசு இல்லாமல் எடுத்தல்.

There are two types of plasmid integration into a host bacteria: Non-integrating plasmids replicate as with the top instance; whereas episomes, the lower example, integrate into the host chromosome.

உயிரணுக்களை உடைத்தல்:

இந்நிலையில் செல்களை உடைக்கும் நொதி அல்லது இலைசொசோம் பாவிக்கப்படும். இந்நொதி இல்லையெனில் பின்வரும் வேதி பொருள்கள் மூலம் உயிரணுக்களை (இ.கோலி) உடைத்து செல்லில் உள்ள பொருள்களை வெளிக்கொண்டு வரலாம்.

திரிசு(tris)

இ.டி.ரீ.ஏ (EDTA)

குளுக்கோசு (Glucose)

இவைகள் செல்லுக்கு வெளியே மற்றும் உள்ளே உள்ள அழுத்த வேறுபாட்டை (osmotic pressure) உருவாக்குவதால் , உயிரணுக்கள் உடைக்கப்பட்டு அதனில் உள்ள கணிமி, நிறப்புரி, ஆர்.என்.ஏ மற்றும் புரதம் வெளிப்படுத்தப்படும்.

தற்காலத்தில் இந்நிலையில் ஆர்என்ஏசு (RNse) என்னும் நொதி சேர்க்கப்பட்டு ஆர்.என்.ஏ மாசு வரமால் தடுக்கப்படுகிறது. இந் நொதி ஆர்.என்.ஏ வை மட்டும் அழிக்க வல்லவை.

கணிமியை நிறப்புரி மாசு இல்லாமல் பிரித்தல்:

கணிமி பிரித்தெடுக்கும் இந் நிலையில் மிக கவனமாக செயல்பட வேண்டிய நிலையாகும். இந்நிலையில் (SDS, NaOH) சேர்க்கும் பொழுது , நீர்மத்தில் ஏற்படும் pH(Alkaline like 12-13) மாற்றங்களால் நிறப்புரி மற்றும் கணிமிகளின் அமைப்புகளில் மாற்றம் ஏற்படுத்தப்பட்டு (denaturation) பிரிக்கப்படும். பின் (CH₃COONA. sodium acetate) சேர்க்கும் போது , நீர்மத்தின் நடுவமான pH (7) வருவதால் பிரிக்கப்பட்ட கணிமி மற்றும் நிறப்புரி இணைவதற்கான சூழ்நிலைகள் உருவாக்கப்படும். கணிமி நிறப்புரியை விட மிகக்குறைவான அளவு (size) இருப்பதால், விரைவாக இணைக்கப்பட்டு ஈரிழையாக மாற்றப்படும். பின் இவைகள் உயர் நிலையில் சுழற்றப்படும் (12,000 rpm for 14 min (RPM- rotation per minute) (centrifuge) போது, நிறப்புரி மற்ற புரதங்களோடு படிந்து படிவமாக மாற்றப்படும். மாறாக கணிமிகள் நீர்மத்தில் நிலைநிறுத்தப்படும். பின் இவைகள் (Alcohol or iso-propanol) சேர்க்கப்பட்டு வீழ்படிவமாக ஆக்கப்படும்.

புரத மாசுக்களை பீனால் (phenol) மூலம் நீக்கலாம். பீனால் நச்சுத் தன்மையுடையதாகவும், மற்றும் அதனின் சிறு துகள்கள் மேற்கொண்டு நாம் செய்யும் மேற்பணிகளை தடுக்கவும் கூடும். பீனால் மாசு வரமால் தடுக்க (CHCL₃) பயன்படுத்தி, உயர் நிலையில் சுற்ற (12,000 rpm for 5 min) (Spin or centrifuge) வேண்டும். CHCL₃ பயன்படுத்தி சுற்றி முடிக்கும் போது, நீர்மம் இரு பகுப்புகளாக பிரிக்கப்படும். CHCL₃ கீழ் பகுப்பிலும் , நாம் பிரிக்க விருப்பும் கணிமிகள் மேல் நிலையிலும் இருக்கும். மேல் நிலையில் இருக்கும் பகுப்பை புதிய சிறு குழாய்க்கு (tube) மாற்றி விட வேண்டும். பீனால் இட்டு சுழற்றும் போது, மூன்று பகு நிலைகளை காணலாம். கீழ் நிலையில் பீனாலும், நடுவத்தில் புரதம் வெள்ளையாக காணப்படும். மேல் பகு நிலையில் நாம் பிரிக்க விருப்பும் கணிமிகள் இருக்கும்.

பின் இவைகளுடன் சரி நிகர் ஆல்ககால் அல்லது இசோ-புரப்பனால் (Iso-propanol) உடன், பத்தில் ஒரு பகுதி சோடியம் அசெடட் அல்லது பொட்டாசியம் அசெடட் சேர்க்கப்பட்டு மிக குளிரில் (-20 0r -70) ஒரு மணிநேரம் அல்லது இரவு முழுவதும் வைக்கப்படும். இந்நிகழ்வின் போது டி.என்.ஏ க்களில் உள்ள நீர் மூலக்கூறுகள் வெளி இழுக்கப்பட்டு , டி.என். ஏ வை வீழ்படிவமாக (precipitation) ஆக்கப்படும். இவ்விடத்தில் மிக குறைந்த அளவு உப்பு (சோடியம் அல்லது பொட்டாசியம்) இடப்படுவதால் இந்நிகழ்வு மிகையாக்கப்படுகிறது. இவ் நிகழ்விற்கு உப்பு உள்ளிடுதல் (Salting In) எனப்பெயர்.

மற்றொரு நிகழ்வான உப்பு வெளிழுத்தலில் (salting out), உப்புக்கள் வெளியேற்றப்படுவதால் டி.என்.ஏ, ஆர்.என்.ஏ அல்லது புரதங்களின் கரையும் தன்மை (solubility) கூட்டப்பட்டு கரைசயலாக மாற்றப்படும்.

மேலும் உப்பு உள்ளிடுதல் (salting in) நிகழ்வில் கூடுதலாக இடப்படும் உப்புகளால், நாம் மேற்கொள்ளும் மேற்பணிகள் பாதிக்கப்படக்கூடும். இவ் உப்புகளை 70% ஆல்ககால் கொண்டு கழுவும்போது, அதனில் உள்ள 30% நீரில் அவ் உப்புகள் வெளியேற்றப்பட்டு தூய்மையான டி.என்.ஏ க்கள் பெறப்படும்.

தற்காலத்தில் ஆயத்த (kit) பொருள்கள் மூலம், மிக எளிதாக கணிமிகள் பிரிக்கப்படுகின்றன. இம்முறையில் பீனால் போன்ற பொருள்கள் பாவிக்கப்படுவதில்லை. மேலும் மிகக் (30 min) குறைந்த நேரத்தில் அதிகளவிலான கணிமிகளை பிரிக்கலாம்.

கணிமி மடிவமைப்புகள்:

டி.என்.ஏ. கூழ்ம மின்புலத் தூள்நகர்ச்சி போது பல்வேறு நிலையில் உள்ள கணிமிகள் நகர்ந்ததை விவரிக்கும் படம்

கணிமிகள் தான் இருக்கும் உயிரினத்தில் அச்செடுக்கப்படுவதால் (replication) அவைகள் பல்கி பெருகும் தன்மை கொண்டுள்ளன. இவ்வாறு டி. என். ஏ பாலிமரேசு மூலம், உருள் வட்ட நகலாக்கம் (rolling circle replication) என்னும் முறையில் மூலம் அச்செடுக்கப்படுவதால், அச்செடுக்கும் நிலையில் பல வகையான வடிவமைப்பு நிலைகளில் கணிமிகள் காணப்படும்.

௧. இறுக்கப்பட்ட கணிமிகள்- super coiled plasmid

கணிமிகளின் ஈரிழைகள் மிக்க இறுக்கப்பட்டு சுருளாக மாற்றப்படும். இவைகள் டி.என்.ஏ. கூழ்ம மின்புலத் தூள்நகர்ச்சி என்னும் நுட்பம் மூலம் நகர்த்தப்படும் போது, விரைவாக நகரும் தன்மையைக் கொண்டுள்ளன.

௨. தளர்ந்த வட்டமான கணிமிகள்- relaxed circular

இவைகள் சுருளாக இருந்த போதிலும், நொதிகளின் செயலால் தளர்வாக காணப்படும். டி.என்.ஏ. கூழ்ம மின்புலத் தூள்நகர்ச்சி இறுக்கப்பட்ட கணிமிகளுக்கு மேலாக இருக்கும் .

௩. துளையிடப்பட்ட வட்டமான கணிமிகள்:- Nicked open circular

ஈரிழையில் ஒரு இழை துளையுடப்பட்டு இருப்பதால் டி.என்.ஏ. கூழ்ம மின்புலத் தூள்நகர்ச்சி நகர்த்தலின் போது மெதுவாக கடக்கும் தன்மை கொண்டுள்ளது.

௪. நேராக்கப்பட்ட கணிமிகள்: - Linearized plasmid

ஈரிழையும் வெட்டப்பட்ட நிலையில் இருப்பதால், மின்புல நகர்த்தலின் போது குறைவாக நகரும்.

இவ்விடத்தில் ஏன் நேராக்கப்பட்ட அல்லது நொதியால் வெட்டப்பட்ட கணிமிகள் மின்புல நகர்த்தலின் போது விரைவாக கடக்காதா? என்ற வினா எழுக்கூடும். ஒரு நேரான கயிறையும், நன்கு சுற்றப்பட்ட வட்ட வடிவிலான கயிறையும் நினைவில் கொள்ளுங்கள். இவ்விரு கயிறையும் நீரில் வீசினால், எவ்வொன்று துரிதமாக ஆழத்தில் சென்று தரையை அடையும் என்பதை கவனியுங்கள். நன்றாக சுற்றப்பட்ட கயிறு விரைவில் தரையில் சேரும், ஏனெனில் அவைகள் நேர்த்தியாக சுற்றப்பட்டு கனமாக இருக்கும். மாறாக நேரான கயிறு நீரில் மிதக்கும். வெட்டப்பட்ட நேரான கணிமிகள் அல்லது பரப்பிகள், கூழ்மத்தில் உள்ள துளைகளில் மெதுவாக நுழைக்கப்பட்டு குறைவாக நகரும்.

இவற்றையும் பாக்க

• பரப்பி
• பல் படிவாக்க இடம்
• டி.என்.ஏ. கூழ்ம மின்புலத் தூள்நகர்ச்சி

மேற்கோள்கள்