DAPI

DAPI ehk 4′,6-diamidiino-2-fenüülindool on orgaaniline aine, mis seostub DNA-ga; tekkinud kompleks on fluorestseeruv nähtava valguse madalamate lainepikkuste juures. Seepärast leiab DAPI laialdast kasutust rakutuumade värvinguks fikseeritud rakkudes, näiteks histokeemias, voolutsütomeetrias ja mujal. DAPI võime läbida elujõuliste rakkude plasmamembraani on üsna piiratud, seepärast ei saa seda kasutada DNA värvinguks elusrakkudes.^[1][2]

DAPI keemiline struktuur

Üldised keemilised ja füüsikalised omadused

DAPI kompleks DNA molekuliga. DAPI on näidatud värviliste sfääridena (süsinikuaatomid rohelised, lämmastikuaatomid sinised) ja DNA halli sekundaarstruktuurina. Kristallstruktuuri koordinaatide allikas: PDB 1D30.

Pulbrilisel kujul müüakse DAPI-t enamasti soolana, kus orgaanilise aine aminorühmad esinevad positiivselt laetud ammooniumioonidena ning vastasioonideks on kas kloriid või laktaat.

• Aine molekulmass: 277 g/mol, vesinikkloriidhappe soola kujul (350 g/mol, CAS number 28718-90-3) või piimhappe- ehk laktaatsoola kujul (457 g/mol, CAS number 28718-91-4);
• Aine brutovalem: C₁₆H₁₅N₅, vesinikkloriidhappe soola puhul C₁₆H₁₅N₅ · 2 HCl ja laktaatsoola puhul C₁₆H₁₅N₅ · 2 C₃H₆O₃;
• Aine lahustuvus: vesinikkloriidhappe soolana vees ligi 20 mg/ml, dimetüülsulfoksiidis ligi 14 mg/ml;
• Spektraalomadused:
  • kompleksis DNA-ga on ergastuse maksimum ligi 360 nm (lähi-ultraviolettkiirgus) ja emissiooni maksimum ligi 460 nm (sügav sinine nähtav valgus);
  • fluorestsentsi kvantsaagise väärtus on 0,92 kompleksis DNA-ga ja 0,04 ilma DNA-ta;
  • fluorestsentsi eluiga on DAPI kompleksis DNA-ga vahemikus 2,2-2,8 ns.^[3][4][5]

DNA värvinguks kasutatakse suhteliselt väikese kontsentratsiooniga DAPI lahuseid (suurusjärgus 0,1 μg/ml ehk ligi 300 nM).^[6]

Seostumine nukleiinhapetega

DAPI seostub DNA väikese vao (ingl k minor groove) adeniini (A) ja tümiini (T) poolest rikaste lõikudega. Lisaks seostub DAPI ka RNA-ga, kuid sel juhul toimub DAPi molekuli interkaleerumine ehk sisenemine adeniini (A) ja uratsiili (U) sisaldavatesse aladesse. Kuna aga DAPI ja RNA vahelise kompleksi fluorestsentsi kvantsaagis on oluliselt väiksem, võrreldes DAPI ja DNA vahelise kompleksiga, siis on mõlemat tüüpi nukleiinhappeid sisaldavates süsteemides (nt fikseeritud rakkudes) DNA ja DAPI vaheline kompleks palju paremini tuvastatav.^[7][8]

Rakendusalad ja analoogid

Näide tuumade värvingust (sinine) DAPI abil veise kopsuarteri endoteeli rakkudes. Rohelisega on näidatud aktiinifilamendid (värving fluorestseeruva falloidiiniga) ja punasega mitokondrid.

DAPI-t kasutatakse laialdaselt rakutuumade asukoha ja suuruse visualiseerimiseks fluorestsentsmikroskoopias, kui vaadeldavas bioloogilises objektis on rakumembraanide läbitavus kunstlikult suurendatud (näiteks fikseerimise tulemusena). Samuti saab DAPI-t kasutada, tuvastamaks anomaalselt suure plasmamembraani läbilaskvuse/poorsusega rakkude populatsiooni (nt nekrootiliste või hilisapoptootiliste rakkude puhul). Sellist lähenemine on rakendatav näiteks voolutsütomeetrilistes mõõtmistes.^[9]

Samadeks või sarnasteks rakendusteks kasutatakse teisigi fluorestsentsvärve, näiteks Sytox Blue, Trypan Blue (trüpaansinine) ja propiidiumjodiid. Võrreldes Sytox Blue ja trüpaansinisega, on DAPI eeliseks signaali suur intensiivsus. Propiidiumjodiid omab aga väga laia ergastus- ja emissioonispektrit (maksimumid vastavalt 535 nm ja 617 nm juures), mis sageli ei võimalda paralleelselt tuumavärvinguga kasutada näiteks immuunvärvingut muude huvipakkuvate rakualade või valkude tuvastamiseks.^[10][11][12]

Samuti kasutatakse DNA märgistamiseks ja rakutuumade visualiseerimiseks Hoechst-tüüpi fluorestsentsvärve (ergastus- ja emissioonimaksimumide lainepikkused väga sarnased DAPI omadele) ja nende derivaate, mille ergastus- ja emissioonimaksimum on nihutatud nähtava ala kõrgemate lainepikkuste juurde (nt SiR-DNA). Viimatimainitud fluorestsentsvärvid läbivad aga rakkude plasmamembraani ning on eeskätt kasutuses elusrakkude mikroskoopias. Samas on tähele pandud, et DNA-ga seonduvad fluorestsentsvärvid ei ole sobilikud kauakestvate mikroskoopiakatsete jaoks, kuivõrd need käivitavad DNA vigastuse parandusmehhanisme ja takistavad rakutsükli normaalset kulgu.^[13][14][15]