RNA interferents

RNA interferents (RNAi) on süsteem elavates rakkudes, mis osaleb geeniaktiivsuste määramisel. RNA interferentsiks on olulised kaks tüüpi väikseid RNA molekule – mikroRNA (miRNA) ja väike interfereeriv RNA (siRNA). RNA-d on otsesed produktid geenidelt, mis saadakse transkriptsiooni teel. Need eelnimetatud väiksed RNA-d võivad seonduda teistele RNA-dele, tõstes või alandades nende aktiivsust, näiteks seondudes mRNA-le, takistavad nad sellelt toimuva translatsiooni ehk valgusünteesi. RNA interferentsil on oluline roll rakkude kaitses parasiitsete geenide (viiruste ja transposoonide) vastu, organismi arengu suunamises ja geeniekspressioonis üldiselt.

Lentiviraalne shRNA kohaletoimetamine ja RNA interferentsi mehhanism imetajate rakkudes

RNAi rada leidub paljudes eukarüootides, kaasa arvatud kõrgemates hulkraksetes loomades, ning mida initsieerib endoribonukleaasne ensüüm Dicer. Dicer lõikab pika kaheahelalise RNA (dsRNA) molekulid väiksemateks umbes 20 nukleotiidi pikkusteks fragmentideks, mida nimetataksegi siRNA-ks. Iga siRNA hargneb lahti kaheks üheahelaliseks RNA-ks (ssRNA): guide-ahelaks ja passenger ehk anti-guide-ahelaks. Passenger-ahel degradeeritakse ehk lagundatakse, kuid guide-ahel kuulub RNA-indutseeritud geenivaigistamiskompleksi (RISC, inglise keeles RNA-induced gene silencing complex). Selle enimuuritumaks tulemiks on post-transkriptsiooniline geenivaigistamine. See ilmneb siis, kui guide-ahel paardub mRNA komplementaarse järjestusega ning katalüütiline RISC-i komponent argonaut tekitab lõike. See protsess on jaotunud süsteemselt terves organismis hoolimata siRNA piiratud molaarsest kontsentratsioonist.

Tänu selektiivsele RNAi mõjule geeniekspressioonis on see väärtuslikuks uurimisvahendiks nii rakukultuurides kui ka elavas organismis. Viies sünteetilist dsRNA rakkudesse, võib see kutsuda esile konkreetsete huvipakkuvate geenide supressiooni. RNAi saab kasutada ka raku suuremahulise geenide väljalülitamise korral, kui süstemaatiliselt lülitatakse välja kõik geenid, aitamaks tuvastada komponente teatud raku protsessidel, nagu raku jagunemisel. Lisaks on RNAi paljutõotav töövahend nii biotehnoloogias kui ka meditsiinis.

Varem on RNA interferentsi tuntud nimetustega "kosupressioon" või "posttranskriptsiooniline geenivaigistamine". Alles siis, kui need näiliselt erinevad protsessid said paremini tuntuks, selgus, et nad kirjeldasid RNAi fenomeni. 2006. aastal jagasid Andrew Fire ja Craig C. Mello Nobeli füsioloogia- või meditsiiniauhinda, mille nad said oma töö eest RNA interferentsi kohta nematoodis C. elegans.^[1] Uurimus avaldati aastal 1998.^[2]

Mehhanism rakus

Dicer proteiin Giardia intestinalis´est, mis viib läbi dsRNA lõigustumise siRNA-deks.^[3]

RNAi on RNA-sõltuv geenivaigistamise protsess, mida viib läbi RNA-indutseeritud vaigistamiskompleks (RISC). Lühikesed kaheahelalised RNA molekulid algatavad RNAi tsütoplasmas, kus nad interakteeruvad RISC-i katalüütilise komponendiga – argonaudiga.^[1] Kui dsRNA on eksogeenne (pärineb laboratoorsest manipulatsioonist või RNA-genoomselt viiruselt), siis see tuuakse kohe tsütoplasmasse, kus argonaut lõikab selle lühikesteks fragmetideks. Initsieeriv dsRNA võib olla ka endogeenne (pärineb rakust endast) pre-mikroRNA-na, mis on ekspresseeritud RNA-kodeerivatest geenidest genoomis. Sellistelt geenidelt sünteesitud primaarsed transkriptid kõigepealt läbivad töötluse rakutuumas, mille järel nad moodustavad pre-miRNA omapäraseid stem-loop struktuure. Seejärel need eksporditakse tuumast tsütoplasmasse, kus ensüüm Dicer nad lõigustab. Nii eksogeene kui ka endogeenne dsRNA rajad ühinevad RISC-i juures.^[4]

dsRNA lõigustumine

Endogeenne dsRNA algatab RNAi, aktiveerides ribonukleaasset valku Dicer,^[5] mis seondub ja lõikab kaheahelalist RNA-d (dsRNA). Tekivad 20–25-nukleotiidised kaheahelalised fragmendid, millel on 2 nukleotiidi pikkune üleulatuv ots ahela 3’ tipus.^[6][7][8][9] Mitmete organismide genoomidel põhinevad bioinformaatika uuringud on näidanud, et see pikkus maksimeerib sihtmärk-geeni spetsiifilisust ja minimeerib mittespetsiifilisi efekte.^[10] Neid kaheahelalisi RNA fragmente nimetatakse väikesteks interfeerseteks RNA-deks (siRNA-d). Need siRNA-d hargnevad kaheks üksikahelaks ja integreeruvad aktiivsesse RISC-i. Pärast integratsiooni siRNA alused paarduvad sihtmärgiks oleva mRNA ahelaga, millele tekitatakse lõige. Niiviisi on sellelt mRNA-lt translatsiooni toimumine takistatud.^[11]

Eksogeense dsRNA tunneb ära ja seondub sellega efektorvalk, tuntud kui RDE-4 C. elegans'is või R2D2 Drosophila's, mis stimuleerib endoribonukleaasi Dicer aktiivsust.^[12] See valk seob ainult pikkasid dsRNA-sid, kuid see mehhanism, mis sellist pikkuse spetsiifilisust põhjustab, on teadmata.^[12] See RNA-seonduv valk osaleb lõigatud siRNAde integreerumisel RISC-i.^[13]

C. elegans's võimendatakse initsiatsiooni vastust sünteesides "sekundaarseid" siRNA-sid. Need sünteesitakse primaarsete siRNA-de või dicer-produtseeritud siRNA-de põhjal.^[14] Need "sekundaarsed" siRNA-d on dicer-produtseeritud siRNA-dest struktuurselt eristatavad ning mida ilmselt sünteesib RNA-sõltuv RNA polümeraas (RdRp).^[15][16]

RISC aktivatsioon ja katalüüs

RNA-indutseeritud geenivaigistamise kompleksi (RISC) aktiivsed komponendid on endonukleaasid, mida nimetatakse argonautideks. Argonaudid lõigustavad siRNA-ga komplementaarselt seotud sihtmärk-mRNA ahela.^[1] Dicer´i lõigatud fragmendid on kaheahelalised, teoreetiliselt võiksid mõlemad ahelad moodustada funktsionaalse siRNA. Kuigi ainult üks ahel kahest- guide-ahel – seondub argonaudiga ja juhib geenivaigistamist. Teine ahel, mida nimetatakse anti-guide- ehk passenger-ahelaks, degradeeritakse RISC-i aktivatsiooni käigus.^[17] Kui alguses arvati, et need kaks ahelat eraldab teineteisest ATP-sõltuv helikaas,^[18] siis nüüdseks on teada, et eraldamise viivad läbi otseselt RISC-i komponendid ATP-sõltumatult.^[19][20] Guide-ahel valitakse selle järgi, kummal on 5’ ots ebastabiilsemalt seondunud oma komplementaarse ahelaga,^[21] kuid see ei sõltu sellest, millises suunas lõikas Dicer dsRNA-d enne RISC-iga integreerumist.^[22] R2D2 valk võib käituda kui eristav faktor, kui see seondub stabiilsemale 5’ otsale passenger-ahelas.^[23]

Kuidas aktiveeritud RISC määrab ära komplementaarse mRNA ahela asukoha rakus, on veel teadmata. mRNA sihtmärkide translatsioon pole absoluutselt vajalik RNAi-vahendatud degradatsiooniks, kuigi on leitud, et lõigustumisprotsess võib seotud olla translatsiooniga.^[24] RNAi võib olla efektiivsem nende mRNA sihtmärkide vastu, mida ei transleerita.^[25] Argonaudid, RISC-i katalüütilised komponendid, lokaliseeruvad tsütoplasmas spetsiifilistes regioonides, mida nimetatakse P-kehakesteks (ka tsütoplasmaatilisteks kehakesteks või GW kehakesteks) ning milles on kõrge mRNA laguproduktide tase.^[26] Samuti on P-kehakestes klasterdunud miRNA aktiivsus.^[27] Defektid P-kehakestes viivad RNAi efektiivsuse alla, viidates, et nad on RNAi protsessis olulise etapi toimumiskohaks.^[28]

Ensüüm Dicer lõigustab kaheahelalise RNA, et moodustada siRNA või miRNA. Need töödeldud RNA-d inkorpureeruvad RISC kompleksi, mille sihtmärgiks on mRNA, et selle kaudu takistada translatsioon^[29]

Transkriptsiooniline vaigistamine

RNA interferentsi raja komponente kasutatakse ka mitmetes eukarüootide genoomide organisatsiooni ja struktuuri hooldamisel. Histoonide modifitseerimine ja heterokromatiini moodustumise indutseerimine represseerivad geene pre-transkiptsiooniliselt.^[30] Sellist protsessi nimetatakse RNA-indutseeritud transkriptsiooniliseks vaigistamiseks ((RITS) inglise keeles RNA-induced transcriptional silencing) ning seda viib läbi valkude kompleks nimetusega RITS. Pärmis S. pombe see kompleks sisaldab argonauti, kromodomäänset valku Chp1 (inglise keeles chromodomain protein Chp1) ja tundmatu funktsiooniga valku Tas3.^[31] Selle tulemusena heterokromatiini moodustumiseks on vajalik argonaudi ja RdRp valkude olemasolu.^[32] Nende geenide deleteerumise tulemusena häirub S. pombe histoonide metülatsioon ja tsentromeeride formeerumine,^[33] põhjustades raku jagunemisel anafaasi aeglustumist või seiskumist.^[34] Mõningatel juhtudel on täheldatud histoonide modifikatsiooniga seotud sarnastel protsessidel stimuleerivat mõju geenide transkriptsioonile.^[35]

Mehhanism, mil viisil RITS indutseerib heterokromatiini moodustumist, on veel vähe uuritud. Enamikul uuringutel on keskendutud pärmi mating-type regioonile, mida teistes organismides ei pruugi olla. Eksisteerivate heterokromatiini regioonide korrashoiuks moodustab RITS kompleksi siRNA-dega, mis on komplementaarsed lokaalsete geenidega, ja seob stabiilselt metüleeritud histoone. Sel viisil käitub RITS kotranskriptsiooniliselt RNA polümeraasi poolt loodud uute pre-mRNA transkriptide degradatsioonile. Sellise heterokromatiini formeerumine on dicer-sõltuv, eeldatavasti seetõttu, et Dicer on vajalik komplemendi alguse loomiseks siRNA ja sihtmärk-transkripti vahel.^[36] Heterokromatiini korrashoid käib ennast varustava tsükkelprotsessina – uued siRNA-d, mis lähevad RITS kompleksi, moodustuvad värsketest RdRp transkriptidest.^[37] Imetajate rakkudes toimuv heterokromatiini korrashoid võib olla RNAi raja komponentidest sõltumatu.^[38]

Erinevused organismide vahel

Organismid erinevad võimelt vastu võtta võõrast dsRNA-d ja kasutada seda RNAi rajas. RNA interferentsi efektid võivad olla nii süsteemsed kui ka päritavad, näiteks taimedel või C. elegans´il, kuid mitte Drosophila’l ja imetajatel. Arvatakse, et taimedes RNAi levib siRNA transpordi teel läbi rakuseintes olevate plasmodesmide.^[18] Päritavus tuleneb RNAi sihtmärgiks olevate promooterite metülatsioonist – uus metüleeritud järjestus replitseeritakse igas rakupõlvkonnas.^[39] Taimede ja loomade vaheline suurem üldine erinevus peitub endogeensete miRNA-de sihtmärgiks määramises. Taimedes miRNA-d on täiuslikult või peaaegu täiuslikult komplementaarsed oma sihtmärk-geeniga ja indutseerivad otse RISC-ilt mRNA lõikamise, kuid loomades on miRNA-d järjestuselt pigem divergeerunud ning indutseerivad translatsioonilise repressiooni.^[40] Selline translatsiooniline efekt võib olla põhjustatud mRNA polüadeniinisaba ja translatsiooni initsiatsiooni faktorite vaheliste interaktsioonide inhibeerimisest.^[41]

Mõnedel eukarüootsetel algloomadel, nagu Leishmania major ja Trypanosoma cruzi, puudub RNAi rada täiesti.^[42][43] Kõik või enamik raja komponente puuduvad osades seentes nagu näiteks mudelorganismis Saccharomyces cerevisiae.^[44] Ühe hiljutise uuringu käigus selgus, et RNAi võib esineda teistes pärmides, nagu Saccharomyces castellii ja Candida albicans, ning demonstreeriti, kuidas S. castellii kahe RNAi-seoselise valgu indutseerimine S. cerevisiae’s tekitas RNA interferentsi.^[45] See, et teatud kott- ja kandseentel puuduvad RNAi rajad, tähendab seda, et RNA vaigistamiseks vajalikud valgud olid iseseisvalt kaduma läinud mitmest seente fülogeneetilisest harust. Võimalik, et see toimus uue sarnase funktsiooniga raja evolutsioneerumise või teatud niššide selektiivse eelise puudumise tõttu.^[46]