ARN interferente

O ARN interferente^[2] (en inglés interfering RNA, iRNA), é unha molécula de ARN que suprime a expresión de xenes específicos utilizando procesos coñecidos globalmente como interferencia por ARN (RNA interference, RNAi).

Véxase tamén: Interferencia por ARN.

O encima Dicer corta ARN bicatenario e xera siRNA ou microARN. Estes ARN pequenos incorpóranse ao complexo RISC (RNA-induced silencing complex), dirixíndoo contra o ARNm complementario, e pode cortalo (siRNA), ou pode inhibir a súa tradución (micro ARN).^[1]

Tipos de ARN interferente

Os ARN interferentes son moléculas pequenas (de 20 a 25 nucléotidos) que se xeran por fragmentación de precursores máis longos. Poden clasificarse en tres grandes grupos:^[3]

Mecanismo de ribointerferencia (RNAi) mediada por siRNA. dsRNA=double stranded RNA= ARN bicatenario.

siRNA

Artigo principal: siRNA.

Os ARN interferentes pequenos (small interfering RNA), abreviados como siRNA son moléculas de ARN bicatenario perfectamente complementarias en toda a súa lonxitude de aproximadamente 20 ou 21 nucleótidos con 2 nucleótidos desemparellados en cada extremo 3'. Cada fibra de ARN ten nos extremos un grupo fosfato 5' e un grupo hidroxilo (-OH) 3'. Esta estrutura provén do procesamento levado a cabo por Dicer, un encima que corta moléculas longas de ARN bicatenario en varios siRNA.^[4] Unha das fibras do siRNA (a fibra "antisentido") ensámblase nun complexo proteico denominado RISC (RNA-induced silencing complex, complexo silenciador inducido por ARN), que utiliza a fibra de siRNA como guía para identificar o ARN mensaxeiro complementario. O complexo RISC cataliza o corte do ARNm complementario en dúas metades, que son degradadas pola maquinaria celular, bloqueando así a expresión do xene. Os siRNA poden ser tamén introducidos de forma exóxena nas células utilizando métodos de transfección baseándose na secuencia complementaria dun xene en particular, coa fin de reducir significativamente a súa expresión.

miRNA

Artigo principal: microARN.

Os microARN ou miRNA son pequenos ARN interferentes que se xeran a partir de precursores específicos codificados no xenoma, que ao se transcribiren sofren un pregamento en forquitas intramoleculares que conteñen segmentos de complementariedade imperfecta. O procesamento dos precursores ocorre xeralmente en dúas fases, catalizado por dous encimas, Drosha no núcleo, e Dicer no citoplasma. Unha das fibras do miRNA (a fibra "antisentido"), como ocorre cos siRNA, incorpórase a un complexo similar ao RISC. Dependendo do grao de complementariedade do miRNA co ARNm, os miRNA poden inhibir a tradución do ARNm ou ben inducir a súa degradación. Porén, a diferenza coa vía dos siRNA, a degradación de ARNm mediada por miRNA comeza coa eliminación encimática da cola poli(A) do ARNm.

piRNA

Artigo principal: ARN que interacciona con piwi.

Os ARN asociados a piwi (Piwi-interacting RNAs) ou piRNA ^[5] xéranse a partir de precursores longos monocatenarios, nun proceso que é independente de Drosha e Dicer. Estes ARN pequenos asócianse cunha subfamilia das proteínas Argonauta denominada proteínas Piwi. Identificáronse decenas de miles de piRNA, pero a súa función é descoñecida (2008). Porén, sábese que, conxuntamente coas proteínas Piwi, son necesarios para o desenvolvemento das células da liña xerminal.

ARNs interferentes e pseudoxenes

En 2008, varios estudos en moscas^[6][7][8][9] e en ratos,^[10][11] proporcionaron nova información: nestes estudos, suxírese unha conexión entre a RNAi e pseudoxenes que fai máis difusa a distinción "tradicional" en tres clases de pequenos ARN: siRNA, miRNA e piRNA (ver un resumo en Sasidharan et al., Nature 2008^[12]).

A definición clásica de pseudoxene é un elemento xenético herdable que é similar a un xene, pero que é afuncional. Porén, o termo "afuncional" é ambiguo: pode significar que non se transcribe, ou que non se traduce ou que non está baixo o control dun promotor. Os pseudoxenes son similares a xenes que codifican proteínas porque normalmente se orixinaron por copia dun xene ancestral, quer por duplicación incorrecta quer por retrotransposición (na que o ADN é primeiro transcrito en ARN e logo "retro-transcrito" en ADN e inserido noutro lugar do xenoma). Como o proceso de copiado non xera unha proteína funcional, os pseudoxenes identifícanse por 'disfuncións' na súa secuencia, como cambios de marco de lectura, ou paradas prematuras. Son interesantes porque constitúen un resto de antigas moléculas codificadas polo xenoma.

Os pseudoxenes son, por tanto, fósiles de xenes de antigas proteínas, e aínda que moitos deles se transcriben, consideráronse como ADN lixo, que consitúe no seu conxunto arredor do 99% do xenoma en humanos. Unha gran parte do ADN "lixo" (junk DNA) está constituída precisamente por pseudoxenes; esta abundancia de pseudoxenes no xenoma (decenas de miles en humanos, case a mesma cantidade de xenes que codifican proteínas) fai improbable que sexan afuncionais. Ademais, unha gran parte deles están sometidos a un proceso de selección natural.^[13] Unha das funcións proposta para os pseudoxenes é a regulación xénica, e o mecanismo proposto para realizar esta función é a interferencia por ARN (RNAi).

Os seis traballos indicados anteriormente describen o descubrimento de pequenas moléculas de siRNA naturais en moscas e ratos, algunhas das cales son potencialmente transcritas a partir de pseudoxenes.

Endo-siRNA

En xeral, o proceso de ribointerferencia (RNAi) implica varios tipos de pequenas secuencias de ARN "guía" que regulan os niveis da proteína diana ao destinar para a degradación o ARNm desta. Nos seis estudos indicados, algúns siRNA procedentes de pseudoxenes orixinan dúas das catro categorías de siRNA naturais (ou endo-siRNA):

• a primeira categoría de endo-siRNA media o silenciamento de transposóns, que é unha característica dos piRNA. A diferenza dos piRNA, que constan de 24 a 30 nucleótidos e utilizan Piwi como proteína efectora, os endo-siRNA de primeira categoría teñen de 21 a 22 nucleótidos, e utlilizan Ago2.
• a segunda categoría orixínase por medio de transcrición bidireccional de loci parcialmente superpostos en fibras opostas de ADN.^[6][9] Identificáronse uns 1000 endo-siRNA deste tipo en moscas, e estudos en ratos mostran algúns exemplos.^[10][11] Os xenes diana desta categoría de endo-siRNA están relacionados con funcións dos ácidos nucleicos, como actividade nuclease ou unión a factores de transcrición.
• a terceira categoría de endo-siRNA detectouse só en ratos^[10][11] e son o produto da interacción dun ARNm transcrito a partir dun xene que codifica unha proteína e un transcrito antisentido a partir do pseudoxene correspondente, que pode estar localizado lonxe do xene codificante, no mesmo cromosoma ou noutro.
• os endo-siRNA da cuarta categoría están moi relacionados cos da terceira: orixínanse a partir de secuencias en forma de forquita (hairpin), que en rato poden proceder das estruturas en repetición invertida dos pseudoxenes. Neste caso, o pseudoxene tamén regula o seu xene codificante, pero o precursor de ARN bicatenario procede da transcrición dunha secuencia con repeticións invertidas que dan lugar a unha forquita.

As publicacións indicadas mostran que as proteínas de rato afectadas polas categorías terceira e cuarta de endo-siRNA están xeralmente implicadas en funcións específicas, como a regulación da dinámica do citoesqueleto, o que indica que a regulación subxacente mediada por pseudoxenes foi seleccionada expresamente para iso, e non xerada simplemente polo emparellamento ao chou de transcritos de xenes e pseudoxenes.

Tamén se encontraron precursores en forquita de endo-siRNA en moscas, pero hai poucas evidencias que os relacionen con pseudoxenes. A maior parte dos endo-siRNA asociados con pseudoxenes, por tanto, foron detectados en ratos. Unha posible explicación é que o xenoma de rato contén moitos máis pseudoxenes ca o xenoma da mosca.^[14]

Porén, para demostrar de forma concluínte a actividade dos pseudoxenes, son necesarios máis experimentos. Por exemplo, eliminar un pseudoxene e demostrar o efecto sobre o xene codificante potencialmente regulado polo pseudoxene.

Como se indicaba ao principio, ademais de conectar pseudoxenes e ribointerferencia (RNAi), estes estudos tamén fan máis difusas as diferenzas entre os tres tipos "tradicionais" de ARN interferente (siRNA, miRNA e piRNA), que son distintos na súa bioxénese e nas súas funcións celulares. Estes estudos indican que os endo-siRNA regulan transposóns (como os piRNA), que poden xerarse a partir de estruturas en forquita (como os miRNA) e que, en moscas, o seu procesamento implica un cofactor similar ao dos miRNA.

O feito de que as liñas de separación entre os distintos tipos de ARN interferente sexan máis difusas, unido ás novas conexións entre pseudoxenes e siRNA, ten interesantes consecuencias evolutivas. En plantas propúxose que as duplicacións invertidas dun xene codificante poderían ser un mecanismo de xeración de novos miRNA.^[15] Deste xeito, algúns endo-siRNA codificados por pseudoxenes poderían proporcionar unha conexión intermedia para comprendermos a evolución da regulación xénica mediada por miRNA.^[16] Aínda que especulativo, un estudo recente do contexto xenómico de máis de 300 loci miRNA en humanos identificou dous en pseudoxenes,^[17] o que apoiaría dita hipótese.