ARN en forquita curto

Un ARN en forquita curto ou ARN en forquita pequeno (shRNA/Vector Forquita, do inglés short hairpin RNA) é unha molécula artificial de ARN cun xiro en forquita moi cerrado que se pode usar para silenciar a expresión xénica por medio de interferencia de ARN.^[1][2][3] A expresión do shRNA en células realízase normalmente pola entrega de plásmidos ou por medio de vectores virais ou bacterianos. O shRNA é un mediador vantaxoso da interferencia de ARN porque ten unha velocidade de degradación e de recambio relativamente baixa. Porén, require o uso dun vector de expresión, que ten o potencial de causar efectos secundarios nas aplicacións medicinais.^[4]

Entrega lentiviral de shRNA e o mecanismo de interferencia de ARN en células de mamíferos.

A elección de promotor é esencial para conseguir unha expresión robusta de shRNA. Primeiramente, utilizáronse os promotores da ARN polimerase III, como U6 e H1; porén, estes promotores carecen de control espacial e temporal.^[4] Entón, pasouse a usar promotores da ARN polimerase II, que son inducibles, para regular a expresión do shRNA.

Entrega

A expresión do shRNA en células pode obterse por medio de entrega por plásmidos ou por medio de vectores virais ou bacterianos.

A entrega de plásmidos ás células por transfección para obter a expresión de shRNA pode realizarse usando rectivos dispoñibles comercialmente in vitro. Porén, este método non é aplicable in vivo e ten, pois, unha limitada utilidade.

O uso dun vector bacteriano para obter a expresión do shRNA nas células é unha estratexia relativamente recente. Baséase nunha investigación que mostra que a Escherichia coli recombinante, que contén un plásmido con shRNA, administrada a ratos pode knock-down a expresión do xene diana no epitelio intestinal.^[5] Esta estratexia foi utilizada en 2012 en ensaios clínicos para intentar tratar pacientes de polipose adenomatosa familiar.^[6]

Poden utilizarse diversos vectores virais para conseguir a expresión dun shRNA en células, como os virus adeno-asociados, adenovirus, e lentivirus. Cos virus adeno-asociados e os adenovirus, os xenomas permanecen episomais. Isto é vantaxoso xa que se evita a mutaxénese insercional. É vantaxoso porque a proxenie da célula perde o virus rapidamente nas divisións celulares a non ser que a célula se divida moi lentamente. Os virus adeno-asociados diferéncianse dos adenovirus en que se lles eliminaron os xenes virais e teñen unha capacidade de empaquetamento diminuída. Os lentivirus intégranse en seccións da cromatina activas transcricionalmente e deste xeito pasan ás células fillas. Con esta estratexia aumenta o risco de mutaxénese insercional; porén, o risco poden reducirse usando un lentivirus deficiente en integrase.^[7]

A proteína Dicer de Giardia intestinalis.^[8]

Mecanismo de acción

Unha vez que o vector se integrou no xenoma do hóspede, o shRNA é entón transcrito no núcleo pola ARN polimerase II ou ARN polimerase III dependendo do promotor elixido. O produto imita o pri-microRNA (pri-miRNA) e é procesado por Drosha. O pre-shRNA resutante é exportado desde o núcleo pola exportina 5. Este produto é despois pocesado por Dicer e cargado no complexo silenciador inducido por ARN (RISC). A febra con sentido (pasaxeira) é degradada. A febra antisentido (guía) dirixe o RISC ao ARNm que ten unha secuencia complementaria. No caso dunha perfecta complementariedade, o RISC corta o ARNm. No caso dunha complementariedade imperfecta, o RISC reprime a tradución do ARNm. En ambos os casos, o shRNA orixina o silenciamento do xene diana.

Aplicacións en terapia xénica

Debido á capacidade do shRNA de proporcionar un silenciamento de xenes específico e de longa duración, houbo moito interese en usar o shRNA para aplicacións terapéuticas. Tres exemplos das terapias baseadas en shRNA explícanse máis abaixo.

Gradalis Inc. desenvolveu a vacina FANG, que se usa no tratamento de cancros avanzados. FANG depende de shRNA bifuncionais (bi-shRNA) contra os factores de crecemento transformantes inmunosupresores TGF β1 e β2.^[9] Recolléronse células tumorais autólogas dos pacientes e introduciuse ex vivo por electroporación un plásmido que codifica o shRNA bifuncional e o factor estimulante das colonias de granulocitos-macrófagos (GMCSF). Estas células foron despois irradiadas e inxectadas de novo no paciente.

Marina Biotech desenvolveu CEQ508, que se usa para tratar a polipose adenomatosa familiar. A CEQ508 usa un vector bacteriano para entregar o shRNA contra a β-catenina.

Gradalis Inc. desenvolveu o shRNA bifuncional STMN1 (pbi-shRNA STMN1), que se utiliza para tatar cancros metastáticos ou avanzados. Este pbi-shRNA STMN1 é contra a stathmina 1 e entrégase intratumoralmente por medio da tecnoloxía de vesículas invaxinadas bilamelares (BIV) lipoplex (LP).

A terapia baseada en sh-RNA ten que enfrontarse a varios retos. O máis significativo é a entrega da molécula. O shRNA entrégase normalmente usando un vector, e, aínda que adoitan ser eficientes, supoñen significativos riscos de seguridade. En particular, a terapia xénica baseada en virus demostrou ser perigosa en pasados ensaios clínicos. Na primeira xeración da terapia xénica retroviral, algúns pacientes tratados con vectores virais para a síndrome de Wiskott–Aldrich desenvolveron leucemia de células T aguda. Determinouse que a causa disto foi a localización da inserción do vector viral.^[10] A sobresaturación potencial do RISC é tamén un problema. Se o shRNA se expresa a niveis que son demasiado altos, a célula podería ser incapaz de procesar correctamente o ARN endóxeno, o cal causaría problemas significativos. Outro desafío é a posibilidade de que o paciente orixine unha resposta inmunitaria contra a terapia.^[11] Finalmente, podería haber efectos fóra de diana e o shRNA podería silenciar outros xenes que non se pretendía tocar. Para desenvolver con éxito novas terapéuticas baseadas no shRNA, todos estes desafíos deben ser tidos en conta.