膜電位固定法

膜電位固定法（まくでんいこていほう、英語: voltage clamp）^[1]、または電圧固定法（でんあつこていほう）^[2]は、電気生理学において電位を設定した状態に保持しながら興奮性細胞の細胞膜を横切るイオン電流を測定する実験手法である^[3]。通常の膜電位固定法では繰り返し膜電位を測定しながら必要量の電流を加えることで固定したい膜電位に変わるようにする。細胞へ注入される電流は細胞膜を横切る電流に等しく逆向きに流れ、記録される電流は設定した膜電位に応じた細胞の反応を示す^[4]。興奮性細胞の細胞膜には多種多様なイオンチャネルが存在しており、その一部は膜電位に応じて性質を変える電位依存性イオンチャネルである。膜電位固定法ではイオン電流とは別で膜電位を人為的に操作できるため、イオンチャネルの電流-電位(I-V)関係を知ることができる^[5]。

ネガティブフィードバックにより機能する膜電位固定法。増幅器は測定された膜電位に基づいてフィードバック的に出力する。目的とする保持電位から現在の膜電位を引いて差分を増幅させたものを出力としている。図ではイカの巨大軸索へ刺した電極を通し、軸索にもう一方の電極で電流を注入している。

歴史

Coleの肖像画。J. Walter Woodburyへ贈られたもの。

膜電位固定法の概念は1947年春^[6]のKenneth Stewart Cole_{（英語版）}^[7]とGeorge Marmontの貢献によるところが大きい^[8]。彼らはイカの巨大軸索に電極を挿入し、電流を流した。Coleらは微小電極（英語版）が使われるより前に膜電位固定法を発展させたため、彼が用いた電極はイカの巨大軸索に挿入しても膜電位が均一になるような長いものであった。これにより初めて膜電位固定が行われたが、Coleと同じ研究所のMarmontは電流固定を強く好んでいたこともあり、彼らはその後膜電位固定法にはあまり深くは貢献できなかった^[6]。

イカは捕食動物から逃げるときのように素早く動く必要がある場合、ジェット噴射を行う。より速く逃げるために軸索は直径約1mmとかなり太くなっている^{[注 1][9]}。イカの巨大軸索は電極を刺すのに十分な大きさの材料であり、アラン・ロイド・ホジキンとアンドリュー・フィールディング・ハクスリーが活動電位を発見した先進的な実験においても基盤となる手法であった^[6]。

ホジキンは膜を通過するイオンの流れを理解するためには膜電位が変動することを解消する必要があると考えていた^[10]。膜電位固定法の開発によりホジキンとハクスリーはイオン電流がどのように活動電位を発生しているのか調べることが可能となり、1952年の夏に活動電位について述べた5つの論文を公表した^[11]。うち最後の論文は数学的に活動電位について解いたホジキン-ハクスリーモデル（英語版）について提唱したものである^[11]。膜電位固定法を用いた彼らの研究は活動電位を詳細に述べることでその後の電気生理学の礎を築くものとなり、彼らは2人そろって1963年のノーベル生理学・医学賞を受賞した^[10]。

技術

膜電位固定法は電流を生み出すことで成り立っている。膜電位は電位測定用の電極を通してアースを基準として記録され、電流を流す用の電極により膜電位を制御するために細胞へ電流が流れる^[1]。実験者が保持電位をセットすると細胞がこの電位にネガティブフィードバックされるように膜電位が維持される^[2]。電極は増幅器へつながれるが、増幅器はオペアンプのような負帰還増幅回路（英語版）となっている。この増幅器は膜電位からの入力以外に保持電位を定めた電位発生装置からも入力を受け、保持電位から膜電位を引く。これにより、保持電位との電位差を増幅し、その分を電流を流す用の電極へ出力する。膜電位が保持電位から逸脱すればこのオペアンプ様の増幅器が保持電位と実際の電位の誤差を感知して電流を生み出す^[1]。フィードバック回路は誤差をゼロに減らすために細胞へ電流を流す。このようにして膜電位固定の回路はイオン電流とは逆向きに等しい電流を流す^[4]。

膜電位固定法の種類

二本刺し膜電位固定法

二本刺し膜電位固定法。

二本刺し膜電位固定法（英語: two-electrode voltage clamp、略:TEVC）はイオンチャネルのような膜タンパク質の研究に用いられる^[12]。特にアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させて用いることが多い。アフリカツメガエルの卵母細胞はサイズが大きいため、制御・操作が比較的容易であり、そのうえ外部から注入されたmRNAを翻訳させて異種発現させることも簡易であるからである^[13]。

TEVCでは電位感知用と電流注入用の2つの低抵抗のピペット^{[注 2]}を用いる。ピペットには伝導性の溶液を満たし、膜電位を人為的に操作するために細胞に刺入する。細胞膜は抵抗器のように誘電体として働き、それゆえ膜表面側が荷電したコンデンサーとして機能する^[14]。微小電極は保持電位に対して膜電位を比較し、正確に電流を再現する。読み取られた電流は細胞の電気的な応答の解析などに利用できる。

低い抵抗が好まれる理由として、誤差が少ないことが上げられる。膜電位を${\displaystyle V_{m}}$、膜抵抗を${\displaystyle R_{m}}$、電極抵抗を${\displaystyle R_{e}}$、保持電位を${\displaystyle V_{hold}}$、増幅率を${\displaystyle k}$とする。なお、基準はアースとする。電流が十分注入されていて膜の電気容量がほぼ0となり、また、電極や機器の寄生容量も0である理想的な状況を考える。すると、2つの抵抗は直列であり、2つの抵抗にかかる電位差は${\displaystyle k(V_{hold}-V_{m})}$であるから電流は等しいので、

${\displaystyle {\frac {V_{m}}{R_{m}}}={\frac {k(V_{hold}-V_{m})}{R_{m}+R_{e}}}}$

となる。ここで、誤差の指標として、${\displaystyle {\frac {V_{m}}{V_{hold}}}}$(1に近いほど誤差が少ない)を用いると、

${\displaystyle {\frac {V_{m}}{V_{hold}}}={\frac {kR_{m}}{(k+1)R_{m}+R_{e}}}}$

となり、${\displaystyle R_{e}}$が小さいほど誤差が少ないことが分かる^[1]。

TEVCは比較的大きい電流が必要な状況では他の膜電位固定法よりも優れている点がある。二本刺しであるために通過する電流が大きくても耐久力があり、パッチクランプ法では制御できないほどの大きい電流を制御することができる^[4]。また、TEVCでは電位が固定されるまでの時間が短く、ノイズが小さいことも優れている^[4]。しかし、TEVCを用いる場合、細胞のサイズについては制限がある。卵母細胞のような直径の大きい細胞では効果的であるものの、小さい細胞では非常に難しい。更に、TEVCはパッチクランプでは可能な細胞内液の条件操作も不可能である^[4]。他の劣った点として局所的に膜電位を固定してしまう虞があるという問題がある。細胞全体が均一に電位固定されていることを空間固定(英語: space clamp)という。イカの巨大軸索で行っていた実験では膜電位固定法を行う際に長いワイヤを用いて均一に軸索全長を膜電位固定したため、空間固定に問題はなかった。しかし、TEVCの微小電極では局所的にしか電流を与えることができず、軸索や樹状突起を持つような不規則な形の細胞では全体に影響できていない可能性がある^[1]。そのため、長い筋線維では電流測定用の電極を2つにして合計3つの電極を用いる方法もある^[4]。

基本的な卵母細胞によるTEVCの方法は以下の通りである^[15]。

まずはテンプレートDNAからRNAを合成して準備しておく。また、測定に用いる卵母細胞を準備するためにカエルを手術し、卵巣から卵胞の塊を取り出す。取り出した卵塊に卵母細胞を覆う卵胞の細胞層をはがすためのコラゲナーゼ(コラーゲン分解酵素)を投与する。その後、バッファーで洗い流し、16℃程度で一晩放置しておく。

インキュベートした細胞は次にインジェクションというRNAを注入する作業を行う。注入に当たっては微小電極作成装置(マイクロピペットプラー)で先端が細くなった針を作成しておく。RNAを注入しやすくするために針の先端は適度に折っておく必要がある。先に針に溶液を満たした後にRNA溶液滴を針先端で陰圧で吸引するなどして針にRNAを入れる。その後、RNAを注入すればインジェクション完了である。発現を待つため、2,3日ほど卵母細胞は16℃程度の環境でインキュベートしておく。

二細胞の電位固定

二細胞においてTEVCを行う研究手法があり、これは細胞と細胞の間のイオン輸送に寄与するギャップ結合の研究で行われる^[16]。ギャップ結合は2つの細胞を直接結ぶ穴のようなものであり、イオンや小分子が自由に流れることができる。ギャップ結合を担うタンパク質のコネクシンやイネキシン（英語版）をmRNA注入により発現させた2細胞ではその間にギャップ結合のチャネルが形成される^[17][18]。2つの細胞がイオン通過のために必要であるため、微小電極も2セット(計4本)用いられる。電位記録用電極と電流注入用電極はどちらも個別に2つの細胞に挿入され、どちらの細胞でも膜電位が固定される^[16]。

ギャップ結合のコンダクタンスを記録する際は2つの細胞膜に電位差を生じさせることで計測する。例えば、2つの細胞を${\displaystyle V_{B}}$の状態からA細胞のみ${\displaystyle V_{A}}$に変化させて固定し、B細胞は${\displaystyle V_{B}}$のまま固定する場合を考える。注入電極の電流と抵抗をそれぞれ${\displaystyle I_{A},I_{B}}$、${\displaystyle R_{sA},R_{sB}}$、各細胞膜の電流と抵抗を${\displaystyle I_{mA},I_{mB}}$、${\displaystyle R_{mA},R_{mB}}$、ギャップ結合を流れる電流とその抵抗を${\displaystyle I_{j}}$、${\displaystyle R_{j}}$とする。直列抵抗による誤差を無視するとギャップ結合における電位差は${\displaystyle V_{A}-V_{B}}$である。ここで${\displaystyle I_{mB}}$は膜抵抗が非常に大きいことからほぼ0であり、無視するとキルヒホッフの法則より${\displaystyle I_{j}=-I_{B}}$である。ゆえに、ギャップ結合におけるコンダクタンス${\displaystyle g_{j}={\frac {1}{R_{j}}}={\frac {I_{j}}{V_{j}}}}$は、${\displaystyle -{\frac {I_{B}}{V_{A}-V_{B}}}}$と求められる^{[注 3][16]}。

電極一つによる膜電位固定法

膜電位固定法は電極が一本だけであっても技術的に可能である。一本(single)なので、TEVCに対してSEVCと呼ばれる。電流注入や電位記録が継続的に行われるかどうかで、連続方式のSEVC-cと不連続方式のSEVC-dに分かれる^[1]。

SEVC-c

→詳細は「パッチクランプ法」を参照

SEVC-cの代表例であるパッチクランプ法（英語: patch clamp）は多種多様なイオンチャネルの研究が可能な研究手法である。電極の先端は1～5μm程度と比較的大きく、表面平滑な電極である。このパッチクランプ用の微小電極はTEVCのように突き刺すためにあるものとは仕様が異なる。電極は突き刺さずに細胞膜に押すようにして用いられ、その後陰圧により細胞膜を電極内側へ吸引する。この吸引により細胞は電極と強固に密着する。これをシールといい、抵抗がギガオーム(1.0×10⁹Ω)単位となるので、ギガオームシールと呼ばれる^[19]。

パッチクランプ法には突き刺す方法によるTEVCでは不可能な小さい細胞での記録ができ、細胞内液の灌流や細胞膜容量の測定もできるという利点がある^[19]。しかし、以下のように劣る点もある。

直列抵抗による誤差

本来、計測したいのは膜電位であるため、膜抵抗のみが発生してほしいところであるが、実際は微小電極にも抵抗がある。これを直列抵抗(series resistance)という。細胞膜の電気容量、抵抗をそれぞれ${\displaystyle C_{m}}$、${\displaystyle R_{m}}$とし、直列抵抗を${\displaystyle R_{s}}$とすると、${\displaystyle R_{m}\geq R_{s}}$の条件では${\displaystyle \tau \approx R_{s}C_{m}}$が導かれる。つまり、直列抵抗が大きいと時定数${\displaystyle \tau }$が大きくなることを意味しており、膜電位が固定されるまでにより時間がかかってしまう^[19]。また、計測した電流が大きいと誤差が大きくなるという問題もある。例えば、${\displaystyle R_{s}}$が${\displaystyle 100M\Omega }$という極端に大きい抵抗であるときを考え、計測した電流が${\displaystyle 1nA}$であるとすると、その誤差は調整しなければ単純計算で${\displaystyle 100\times 10^{6}\times 1\times 10^{-9}=100mV}$という大きな誤差につながる。これらの直列抵抗による誤差を解消するために、各パッチクランプ機器には補償回路が組み込まれている^[19]。

容量性の誤差

微小電極は電極内の電解質がガラスという絶縁体によって細胞外液と区分されているため電気容量を持っており、これによる誤差が生じる。いわゆる浮遊容量と呼ばれるものの一つである。電気容量は面積に比例し、コンデンサー(今回は微小電極)の間隔に反比例する。そのため、実験を行う際は細胞外液をなるべく浅くすることでガラスが液体に触れる表面積を小さくすることで浮遊容量を軽減できる。また、シリコンなどの物質でコーティングしたり厚めのガラス管を用いたりすることで、ガラス電極の電極内・細胞外液を隔てる距離を大きくするのも有効である^[19]。

空間固定

SEVC-cにおいても細胞の局所的な部分に電流を流すため、電極の近傍ではなく遠い位置の場合、電流の変化が届きにくくなる。つまり、空間固定がなされないという問題が生じ、樹状突起などの神経細胞で記録する際に支障となる。ただし、パッチクランプ法全てで空間固定がなされないわけではなく、インサイド-アウトやアウトサイド-アウトといったピペット先端に膜を張り付かせる方法では対象となる面積が小さいため問題とならない^[1]。

細胞内液の洗い流し

パッチクランプでは電極内液を細胞内に注入することができるので細胞質の条件を多様に変えることができる、という利点がある。一方で、細胞内が電極内液に変わってしまうので実際の細胞内液の条件ではなくなってしまうという問題がある。多くの場合、細胞の細かなタンパク質の条件等を完全に再現することはできないので、計測している電流が人工的に作られた条件となり、生理的でない可能性がある^[1]。

SEVC-d

SEVC-cと違ってSEVC-dでは電流の注入と電位の記録に異なった方法が用いられる。SEVC-dの増幅器は時分割処理によって規則的かつ高頻度に電流注入と電位記録を切り換える^[20]。2つの電極があるようで電極としては1本である。2つの機能を1つの電極で切り換える時間の周期はデューティ比で表される^[21]。

各周期においてまず膜電位が記録されるとする。SEVC-d機器ではサンプルアンドホールド（英語版）回路を適用しており、測定された膜電位がまずここでサンプル(抽出)される。サンプルされた膜電位は保持電位と比較され、その差分が増幅器の出力となるが、電位記録中はスイッチが電位記録用の方になっているため、まだ増幅器で増幅した電流を流す回路が閉回路ではない。膜電位の記録期間が終わり、電流注入の期間となるとスイッチが傾くことで閉回路となり、増幅された電流が細胞膜の方まで流れる。このとき増幅器から出力される電位はホールド(保持)されて電流固定となっているため、この期間内で流れる電流は変わらない。スイッチが傾いてまた電位記録の期間になると流れた電流により変化した膜電位がサンプルされ、膜電位に近づくようになっていく、という仕組みである^[20]。

膜電位固定の精度を高めるためには時定数はマイクロ秒のオーダーに抑えるべきである。そのためには逆にスイッチの周期を10kHzのオーダーという高周波数にできる機器を使用する必要がある。10kHz以上の高周波数でスイッチの周期を変えることができていれば不連続な電流注入でも膜電位固定は平滑・線形とみなせる^[14]。

SEVC-dのSEVC-cに対する利点は細胞のサイズ差による影響を受けにくい点である。SEVC-dでは細胞サイズを10倍変えても実質的には変わらなかったとの報告がある^[21]。しかし、周期が存在することによりよく膜電位が固定できないという問題は生じる^[21]。

脂質平面膜法

パッチクランプ法では小さな細胞でもできるという利点があるが、原核生物のような極めて小さい細胞に適応するには困難である^{[注 4]}。そこで、人工的に作成した脂質二重膜にチャネルを入れておくことで電気生理学的解析を可能にしたのが脂質平面膜法（英語: planar lipid bilayer method）である。例えば2つの箱に電解質を満たし、直径0.1mm程度の穴で行き来ができるものとする。ここにヘキサデカンなどの有機溶媒に溶かしたリン脂質を穴に塗布すると箱の中は電解質水溶液であるため、リン脂質は穴の辺縁部に親水性の頭部を向け、穴の中心部に脂溶性の尾部を向ける。これにより微小な穴に脂質平面膜を構成することができる^[23]。

この作成した脂質平面膜にチャネルを入れるために、ベシクル(小胞)にチャネルを入れておいて膜融合する方法が一般的にとられる。膜融合に際しては浸透圧がベシクル内 > ベシクルを入れた溶液 > もう一方の箱の溶液となっている方が膜融合が起こりやすい。また、攪拌も同時に行うことで膜融合を起こりやすくする。こうしてベシクルが膜融合を起こすといきなり電流が引き起こされることから分かる。一見、単一チャネル記録法として有用であるように見えるが、ベシクルに必ずしも一つのチャネルしかないとは限らないことに注意する^[23]。

CBB

従来の脂質平面膜法は水中の中に脂質を入れるという方法であったが、それ以来、油の中に水滴を入れるという考えも提案された。中でも画期的な方法が福井大学の研究者らにより考案されたCBB法（英語: Contact Bubble Bilayer）^{[注 5]}である。CBB法では2つの電極を適度な距離にし、微小電極の先から水滴を膨らませれば、接触した2つの脂質で覆われた水滴ができるという方法である。各電極内液の組成を変え、チャネルを含んだリポソームを入れることで自由な実験が可能である。膜が破れやすそうに見えることが欠点に思えるが、微小電極の先から再度水滴を膨らませれば逐一電極の交換を行わずとも膜を再生できるという利点がある^[25]。

オートパッチクランプ法

パッチクランプ法は膜電位固定法を飛躍的に進歩させたとはいえ、初学者にとっては技術的な困難が立ちはだかる。そこで、細胞さえあれば自動でパッチクランプが行われるような方法がオートパッチクランプ法（英語: automated patch clamp）である。細胞が入った容器の底に細胞より小さい穴があり、そこで細胞が吸引されて、パッチクランプ法でいうギガオームシールが形成される。ただし、これにより人の操作によるパッチクランプ法が取って代わられるというわけではなく、まだまだ多くの限界がある。利点としては一度に何個もの細胞を測定できること、迅速に遂行できるため一日に何個も測定できることが挙げられる^[27][28]。

数理モデル

制御理論の観点から見ると、膜電位固定法は神経細胞の膜へ高出力なフィードバック制御法を応用した例の一つである^[29][30]。数学的に、膜電位は注入した電流${\displaystyle I_{app}(t)}$による入力と膜電位${\displaystyle V(t)}$による出力から成るモデルで説明される。ホジキン-ハクスリーモデルでは神経細胞の細胞膜にはNa⁺とK⁺のイオン電流やリーク電流が含まれており、常微分方程式で表されることを説明した^[31]。

${\displaystyle C_{m}{\frac {dV}{dt}}=-{\bar {g}}_{\text{K}}n^{4}(V-V_{\text{K}})-{\bar {g}}_{\text{Na}}m^{3}h(V-V_{\text{Na}})-{\bar {g}}_{\text{L}}(V-V_{L})+I_{app}}$

${\displaystyle {\frac {dp}{dt}}=\alpha _{p}(V)(1-p)-\beta _{p}(V)p,\quad p=m,n,h}$

${\displaystyle C_{m}}$は細胞膜の電気容量、${\displaystyle {\bar {g}}_{\text{Na}}}$、${\displaystyle {\bar {g}}_{\text{K}}}$、${\displaystyle {\bar {g}}_{\text{L}}}$は各イオン電流とリーク電流の最大のコンダクタンス、${\displaystyle V_{\text{Na}}}$、${\displaystyle V_{\text{K}}}$、${\displaystyle V_{\text{L}}}$は反転電位、${\displaystyle \alpha _{p}}$と${\displaystyle \beta _{p}}$はイオンチャネルの電位依存性の速度定数、${\displaystyle m}$、${\displaystyle h}$、${\displaystyle n}$はイオンチャネルの開閉に伴う変数である。

フィードバック機構についても厳密に記述すると以下のように表せる^[30]。

${\displaystyle I_{app}(t)=k(V_{\text{ref}}-V(t))}$

${\displaystyle k}$はゲイン(増幅値)であり、これを恣意的に増加させれば膜電位${\displaystyle V(t)}$が基準電位${\displaystyle V_{\text{ref}}}$に近づくようになる^[30]。この事実は力学系における一般的な性質というわけではなく、ゲインが高いとふつう不安定現象を引き起こす^[32]が、このモデルの構造や性質上可能である。特に、イオンチャネル開閉に関わる変数である${\displaystyle p=m,h,n}$は膜電位に依存し、指数関数的に収束する強い安定性を持つ^[30][33]。

脚注

1. 軸索は太い方がより速く信号が伝播する。
2. 化学の実験で用いるようなピペットではなく、微小電極としてのピペットである。
3. 実際は直列抵抗${\displaystyle R_{sA},R_{sB}}$は無視できず、正確な測定に支障をきたす。
4. 不可能、というわけではない。実際に大腸菌に対してはスフェロプラストにして巨大化させることでパッチクランプ法を適用することができる^[22]。
5. 接触バブル二重膜法^[24]、接触液胞二重膜法^[25]、液滴接触二重膜法^[26]など定訳がないため、以降CBBと呼ぶ。