현미경학

현미경학, 마이크로스코피(microscopy), 현미경 관찰은 현미경을 사용하여 육안으로는 너무 작아서 볼 수 없는 대상(정상적인 눈의 해상도 범위를 벗어나는 물체)을 관찰하는 기술 분야이다.^[1] 현미경학에는 잘 알려진 세 가지 분야가 있다: 광학, 전자현미경, 그리고 주사 탐침 현미경, 그리고 새롭게 떠오르는 엑스선 현미경 분야가 있다.

주사전자현미경으로 본 꽃가루 이미지 (가색)

생화학 실험실에서의 현미경 검사

광학 현미경과 전자 현미경은 전자기파/전자빔이 표본과 상호 작용하면서 발생하는 회절, 반사, 또는 굴절을 통해 산란된 방사선이나 다른 신호를 수집하여 이미지를 생성하는 것을 포함한다. 이 과정은 샘플의 넓은 영역을 조사하는 방식(예: 일반 광학 현미경 및 투과전자현미경)이나 샘플 위로 미세한 빔을 스캔하는 방식(예: 공초점 레이저 주사 현미경 및 주사전자현미경)으로 수행될 수 있다. 주사 탐침 현미경은 주사 탐침이 대상 물체의 표면과 상호 작용하는 것을 포함한다. 현미경학의 발전은 생물학을 혁신하고 조직학 분야를 탄생시켰으며, 따라서 생명과학과 자연과학에서 필수적인 기술로 남아 있다. 엑스선 현미경은 3차원적이고 비파괴적이므로 동일한 샘플을 생체내 또는 4D 연구를 위해 반복적으로 영상화할 수 있으며, 고해상도 기술을 희생하기 전에 연구 중인 샘플의 "내부"를 볼 수 있는 기능을 제공한다. 3D 엑스선 현미경은 컴퓨터 단층 촬영 (미세CT) 기술을 사용하여 샘플을 360도 회전시키고 이미지를 재구성한다. CT는 일반적으로 평판 디스플레이로 수행된다. 3D 엑스선 현미경은 4배에서 40배까지 다양한 대물렌즈를 사용하며, 평판도 포함할 수 있다.

역사

안토니 판 레이우엔훅 (1632–1723)

현미경학(광학 현미경) 분야는 최소 17세기로 거슬러 올라간다. 초기 현미경인 단일 렌즈 돋보기는 제한된 배율을 가졌으며, 13세기 안경에 렌즈가 널리 사용되면서부터 최소한 그만큼 오래되었다.^[2] 하지만 더 발전된 복합 현미경은 약 1620년경 유럽에서 처음 나타났다.^[3][4] 초기 현미경학자 중에는 1610년에 망원경의 초점을 가까운 작은 물체를 볼 수 있도록 맞추는 방법을 발견한 갈릴레오 갈릴레이^[5][6]와 1620년경에 복합 현미경을 발명했을 가능성이 있는 코르넬리스 드레벨이 있다.^[7][8] 안토니 판 레이우엔훅은 1670년대에 매우 높은 배율의 단순 현미경을 개발했으며, 종종 최초로 인정받는 현미경학자이자 미생물학자로 간주된다.^[9][10]

광학 현미경

 광학 현미경 문서를 참고하십시오.

입체 현미경

광학 또는 광 현미경은 샘플을 통과하거나 샘플에서 반사된 가시광선을 단일 렌즈 또는 여러 렌즈를 통해 통과시켜 샘플을 확대하여 볼 수 있게 한다.^[11] 결과 이미지는 눈으로 직접 감지하거나, 사진건판에 이미지화하거나, 디지털로 캡처할 수 있다. 단일 렌즈와 그 부속품, 또는 렌즈 시스템 및 이미징 장비는 적절한 조명 장비, 샘플 스테이지 및 지지대와 함께 기본적인 광학 현미경을 구성한다. 가장 최근의 발전은 CCD 카메라를 사용하여 관심 전시물을 포착하는 디지털 현미경이다. 이미지는 컴퓨터 화면에 표시되므로 접안렌즈가 필요 없다.^[12]

한계

표준 광학 현미경(명시야 현미경)의 한계는 세 가지 영역에 있다.

• 이 기술은 어둡거나 강하게 굴절하는 물체만을 효과적으로 이미지화할 수 있다.
• 입사 파장에 따라 회절 한계 해상도가 있다. 가시 범위에서 광학 현미경의 해상도는 약 0.2 마이크로미터로 제한되며(참조: 현미경) 실제 배율 한계는 약 1500배이다.^[13]
• 초점면 외부의 초점 이탈 광선은 이미지 선명도를 저하시킨다.^[14]

특히 살아있는 세포는 내부 구조가 무색 투명하기 때문에 성공적으로 연구하기에 충분한 대비가 부족한 경우가 많다. 대비를 높이는 가장 일반적인 방법은 선택적 염료로 구조를 염색하는 것이지만, 이는 종종 샘플을 죽이고 고정하는 것을 수반한다.^[15] 염색은 또한 인공물을 유발할 수 있는데, 이는 표본 처리로 인해 발생하는 겉보기 구조적 세부 사항이므로 표본의 특징이 아니다. 일반적으로 이러한 기술은 세포 구조의 굴절률 차이를 이용한다. 명시야 현미경은 유리창을 통해 보는 것과 유사하다. 유리를 보는 것이 아니라 유리에 묻은 먼지만을 보는 것이다. 유리가 더 밀도가 높은 물질이므로 통과하는 빛의 위상에 차이가 발생한다. 인간의 눈은 이러한 위상 차이에 민감하지 않지만, 이 위상 차이를 진폭(광 강도) 차이로 바꾸는 영리한 광학적 해결책이 고안되었다.

기법

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표본의 대비를 개선하거나 샘플의 구조를 강조하려면 특수 기술을 사용해야 한다. 대비를 높이거나 샘플에 라벨을 붙이는 데 사용할 수 있는 방대한 현미경 기술이 있다.

• 휴지 샘플에서 대비를 생성하는 데 사용되는 투과 조명 기술의 네 가지 예. 1.559 μm/픽셀.
• 
  명시야 조명, 샘플 대비는 샘플의 빛 흡광도에서 비롯됨
• 
  교차 편광 조명, 샘플 대비는 샘플을 통한 편광 빛의 회전에서 비롯됨
• 
  암시야 조명, 샘플 대비는 샘플에 의해 산란된 빛에서 비롯됨
• 
  위상차 조명, 샘플 대비는 샘플을 통한 다른 광 경로 길이의 간섭에서 비롯됨

명시야

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명시야 현미경은 모든 광학 현미경 기술 중 가장 단순하다. 샘플 조명은 투과된 백색광, 즉 아래에서 조명하고 위에서 관찰하는 방식이다. 대부분의 생물학적 샘플의 낮은 대비와 초점 이탈 물질의 흐림으로 인한 낮은 겉보기 해상도가 한계이다. 이 기술의 단순성과 최소한의 샘플 준비 요구 사항은 중요한 장점이다.

사방 조명

사방(측면) 조명을 사용하면 이미지에 3차원적인 모습이 나타나며, 그렇지 않으면 보이지 않는 특징들을 강조할 수 있다. 이 방법을 기반으로 한 최근 기술로는 Hoffmann 변조 대비가 있으며, 이는 세포 배양에 사용되는 도립 현미경에서 발견되는 시스템이다. 사방 조명은 투명한 표본에서도 대비를 향상시키지만, 빛이 축에서 벗어나서 들어오기 때문에 초점을 변경하면 물체의 위치가 이동하는 것처럼 보인다. 이러한 한계로 인해 광학 단층 촬영이나 Z축에 대한 정확한 측정과 같은 기술은 불가능해진다.

암시야

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암시야 현미경은 염색되지 않은 투명한 표본의 대비를 개선하기 위한 기술이다.^[16] 암시야 조명은 조심스럽게 정렬된 광원을 사용하여 이미지 평면으로 들어오는 직접 투과된(산란되지 않은) 빛의 양을 최소화하고 샘플에 의해 산란된 빛만 수집한다. 암시야는 이미지 대비, 특히 투명한 물체의 대비를 극적으로 향상시킬 수 있으며, 장비 설정이나 샘플 준비가 거의 필요하지 않다. 그러나 이 기술은 많은 생물학적 샘플의 최종 이미지에서 낮은 광도에 시달리며, 낮은 겉보기 해상도의 영향을 계속 받는다.

라인버그 조명 아래의 돌말류

라인버그 조명은 암시야 조명의 변형으로, 콘덴서 바로 앞에 투명한 유색 필터를 삽입하여 높은 개구수를 가진 광선이 낮은 개구수를 가진 광선과 다르게 착색되도록 한다 (예: 표본의 배경은 파란색이지만 물체는 자체 발광하는 붉은색으로 보일 수 있다). 다른 색상 조합도 가능하지만, 그 효과는 상당히 가변적이다.^[17]

분산 염색

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분산 염색은 무색 물체에 색깔 있는 이미지를 생성하는 광학 기술이다. 이는 광학 염색 기술이며 색상 효과를 내기 위해 염색약이나 염료가 필요하지 않다. 분산 염색의 광범위한 기술에는 밝은 시야 베케선, 사방, 암시야, 위상차 및 대물렌즈 스톱 분산 염색의 다섯 가지 현미경 구성이 사용된다.

위상차

탈회되지 않은 유리 연골의 위상차 광학 현미경 사진으로, 연골세포와 세포소기관, 골연골연결 그리고 세포외기질을 보여준다.

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전자현미경에서: 위상차 이미징

더 정교한 기술은 광학 밀도의 비례적인 차이를 보여줄 것이다. 위상차는 굴절률의 차이를 대비의 차이로 보여주는 널리 사용되는 기술이다. 이는 1930년대 네덜란드 물리학자 프리츠 제르니커에 의해 개발되었으며 (이 공로로 그는 1953년 노벨상을 수상했다). 예를 들어 세포 내 핵은 주변 세포질에 비해 어둡게 나타날 것이다. 대비는 뛰어나지만 두꺼운 물체에는 사용할 수 없다. 종종 작은 물체 주위에도 후광이 형성되어 세부 사항을 가린다. 이 시스템은 콘덴서 내의 원형 애뉼러스로 구성되어 원뿔형의 빛을 생성한다. 이 원뿔은 위상 대물렌즈 내의 유사한 크기의 링에 중첩된다. 모든 대물렌즈는 다른 크기의 링을 가지고 있으므로, 모든 대물렌즈에 대해 다른 콘덴서 설정이 선택되어야 한다. 대물렌즈의 링은 특별한 광학적 특성을 가지고 있다. 먼저 직접광의 강도를 감소시키지만, 더 중요한 것은 약 1/4 파장의 인공적인 위상차를 생성한다는 것이다. 이 직접광의 물리적 특성이 변함에 따라 회절광과의 간섭이 발생하여 위상차 이미지가 생성된다. 위상차 현미경의 한 가지 단점은 후광 형성(후광-광 링)이다.

미분 간섭 대비

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더 우수하고 훨씬 비싼 기술은 간섭 대비를 사용하는 것이다. 광학 밀도의 차이는 돋을새김의 차이로 나타날 것이다. 세포 내 핵은 조르주 노마르스키의 가장 흔히 사용되는 미분 간섭 대비 시스템에서 실제로 구형으로 나타날 것이다. 그러나 이는 광학적 효과이며, 돋을새김이 반드시 실제 모양과 일치하지 않는다는 점을 명심해야 한다. 대비는 매우 좋고 콘덴서 조리개는 완전히 열어 사용할 수 있어 피사계 심도를 줄이고 해상도를 최대화한다.

이 시스템은 콘덴서 내의 특수 프리즘(노마르스키 프리즘, 울라스톤 프리즘)으로 구성되어 빛을 보통 광선과 특이 광선으로 분할한다. 두 광선 사이의 공간적 차이는 최소이다 (대물렌즈의 최대 해상도보다 작다). 표본을 통과한 후, 광선은 대물렌즈 내의 유사한 프리즘에 의해 다시 합쳐진다.

균질한 표본에서는 두 광선 사이에 차이가 없어 대비가 생성되지 않는다. 그러나 굴절 경계(예: 세포질 내의 핵) 근처에서는 보통 광선과 특이 광선 사이의 차이가 이미지에 돋을새김을 생성한다. 미분 간섭 대비는 편광 광원을 필요로 한다. 두 개의 편광 필터가 광 경로에 장착되어야 하는데, 하나는 콘덴서 아래(편광판)에, 다른 하나는 대물렌즈 위(검광판)에 장착된다.

참고: 현미경의 광학 설계가 두 빔의 상당한 측면 분리를 유발하는 경우, 이는 고전적인 간섭 현미경에 해당하며, 이는 릴리프 이미지를 생성하지 않지만 미세 물체의 질량-두께를 정량적으로 결정하는 데 사용될 수 있다.

간섭 반사

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간섭을 사용하는 추가적인 기술은 간섭 반사 현미경 (반사 간섭 대비, RIC라고도 함)이다. 이는 간섭 신호를 생성하기 위해 세포가 슬라이드에 부착되는 것에 의존한다. 세포가 유리에 부착되어 있지 않으면 간섭이 발생하지 않는다.

간섭 반사 현미경은 DIC에서 사용되는 것과 동일한 요소를 사용하여 얻을 수 있지만, 프리즘은 사용하지 않는다. 또한, 감지되는 빛은 반사된 빛이며, DIC가 사용될 때처럼 투과된 빛이 아니다.

형광

이미지에는 인공물이 포함될 수도 있다. 이것은 공초점 레이저 스캐닝 형광현미경으로 촬영한 애기장대 꽃밥 (수술의 일부)의 현미경 사진이다. 사진은 다른 것들 중에서도 꽃밥 바로 아래에 아름다운 붉은 흐르는 칼라 모양의 구조를 보여준다. 그러나 온전한 애기장대 수술은 이러한 칼라를 가지고 있지 않으며, 이것은 고정 인공물이다: 수술은 사진 프레임 아래에서 잘려 나갔고, 수술 줄기의 표피 (세포의 상층)가 벗겨져 비특징적인 구조를 형성했다. 사진: 탈린 공과대학교의 헤이티 파베스.

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특정 화합물이 고에너지 빛으로 조명되면 더 낮은 주파수의 빛을 방출한다. 이 효과를 형광이라고 한다. 종종 표본은 화학적 구성에 따라 특징적인 자가형광 이미지를 보여준다.

이 방법은 단일 분자까지 감지할 수 있을 정도로 매우 민감할 수 있으므로 현대 생명 과학에서 매우 중요하다. 많은 형광 염료가 구조나 화학 화합물을 염색하는 데 사용될 수 있다. 강력한 방법 중 하나는 면역염색에서처럼 항체를 형광단에 결합시키는 것이다. 일반적으로 사용되는 형광단의 예로는 플루오레세인 또는 로다민이 있다.

항체는 화학 화합물에 맞게 맞춤 제작될 수 있다. 예를 들어, 흔히 사용되는 한 가지 전략은 유전 코드(DNA)를 기반으로 단백질을 인공적으로 생산하는 것이다. 이 단백질은 토끼를 면역화하는 데 사용될 수 있으며, 단백질에 결합하는 항체를 형성한다. 그런 다음 항체는 화학적으로 형광단에 결합되어 연구 중인 세포에서 단백질을 추적하는 데 사용된다.

녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 고효율 형광 단백질은 형광 화합물의 유전자 발현을 표적 단백질의 발현과 연결하는 분자생물학 기술인 유전자 융합을 사용하여 개발되었다. 이 결합된 형광 단백질은 일반적으로 유기체에 독성이 없으며 연구 중인 단백질의 기능에 거의 영향을 미치지 않는다. 유전자 변형 세포 또는 유기체는 형광 태그된 단백질을 직접 발현하여 생체내에서 원래 단백질의 기능을 연구할 수 있게 한다.

단백질 결정 성장은 단백질과 염 결정 모두를 초래한다. 둘 다 무색이며 현미경으로만 볼 수 있다. 단백질 결정의 회수는 단백질의 고유 형광 또는 투과 현미경을 사용하여 수행할 수 있는 이미징을 필요로 한다. 두 방법 모두 단백질이 280 nm에서 빛을 흡수하므로 자외선 현미경을 필요로 한다. 단백질은 또한 280 nm 빛으로 여기될 때 약 353 nm에서 형광을 발한다.^[18]

형광 방출은 여기광과 파장(색상)이 다르기 때문에 이상적인 형광 이미지는 형광 염료로 표지된 관심 구조만 보여준다. 이러한 높은 특이성으로 인해 형광 광학 현미경은 생물의학 연구에서 널리 사용된다. 다양한 형광 염료를 사용하여 서로 다른 생물학적 구조를 염색할 수 있으며, 이들은 염료의 개별 색상으로 인해 여전히 특이성을 유지하면서 동시에 감지될 수 있다.

여기광이 관찰자나 검출기에 도달하는 것을 막으려면 고품질의 필터 세트가 필요하다. 이 필터 세트는 일반적으로 여기 파장 범위를 선택하는 여기 필터, 양색성 거울, 그리고 여기광을 차단하는 방출 필터로 구성된다. 대부분의 형광 현미경은 검출기로 들어가는 여기광의 양을 더욱 줄이기 위해 에피조명 모드(샘플의 한쪽에서 조명 및 감지)로 작동된다.

같이 보기: 내부전반사형광현미경 신경과학

공초점

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공초점 레이저 주사 현미경은 집중된 레이저 빔(예: 488 nm)을 사용하여 샘플을 점대점 방식으로 스캔하여 형광을 여기한다. 방출된 빛은 핀홀을 통해 유도되어 초점이 맞지 않는 빛이 일반적으로 광전 증폭관인 검출기에 도달하는 것을 방지한다. 이미지는 컴퓨터에서 구성되며, 여기 레이저의 위치에 따라 측정된 형광 강도를 플로팅한다. 전체 샘플 조명과 비교하여 공초점 현미경은 약간 더 높은 측면 해상도와 현저히 향상된 광학 섹션닝(축 해상도)을 제공한다. 따라서 공초점 현미경은 3D 구조가 중요한 곳에서 일반적으로 사용된다.

공초점 현미경의 하위 분류로는 샘플 전반에 걸쳐 여러 지점을 동시에 스캔할 수 있는 회전 디스크 현미경이 있다. 핀홀이 있는 해당 디스크는 초점 이탈 빛을 차단한다. 회전 디스크 현미경의 광 검출기는 일반적으로 EM-CCD 또는 sCMOS인 디지털 카메라이다.

투광자 현미경

투광자 현미경은 레이저 스캔 현미경이기도 하지만, 자외선, 파란색 또는 녹색 레이저 빛 대신 펄스 적외선 레이저를 여기용으로 사용한다. 레이저의 아주 작은 초점에서만 두 광자 여기에 의해 형광을 생성할 수 있을 정도로 강도가 충분히 높아서 초점 이탈 형광이 생성되지 않고 이미지를 깨끗하게 만들 핀홀이 필요 없다.^[19] 이를 통해 산란 조직 깊숙이 이미징할 수 있으며, 공초점 현미경으로는 광자를 효율적으로 수집할 수 없을 것이다.^[20] 넓은 시야 검출 기능을 갖춘 투광자 현미경은 뇌 조직에서 기능적 이미징, 예를 들어 칼슘 이미징에 자주 사용된다.^[21] 이들은 여러 회사에서 다광자 현미경으로 판매되지만, 2광자 여기 대신 3광자 여기를 사용하는 이점은 미미하다.

단면 조명 현미경 및 광시야 형광 현미경

 이 부분의 본문은 광시트 형광 현미경입니다.

원통형 렌즈를 통해 좁은 각도로 빛을 집중시키거나 대물렌즈 축에 수직인 평면에서 빛 선을 스캔하여 형성된 광 평면을 사용하면 고해상도 광학 섹션을 얻을 수 있다.^[22][23][24] 단일 평면 조명 또는 광 시트 조명은 다중 프리즘 빔 확장기를 포함하는 빔 성형 기술을 사용하여도 달성된다.^[25][26] 이미지는 CCD에 의해 캡처된다. 이러한 변형은 매우 빠르고 높은 신호 대 잡음비 이미지 캡처를 허용한다.

광시야 다광자 현미경

 이 부분의 본문은 광시야 다광자 현미경입니다.

광시야 다광자 현미경^{[27][28][29][30]}는 스캔 없이 물체의 넓은 영역을 조명하고 이미징하는 광학 비선형 이미징 기술을 말한다. 두 광자 형광 또는 2차 고조파 발생과 같은 비선형 광학 과정을 유도하기 위해서는 높은 강도가 필요하다. 스캐닝 다광자 현미경에서는 빛을 집중시켜 높은 강도를 얻고, 빔 스캐닝을 통해 이미지를 얻는다. 광시야 다광자 현미경에서는 광학적으로 증폭된 펄스 레이저 소스를 사용하여 넓은 시야(약 100 μm)를 얻음으로써 높은 강도를 가장 잘 달성한다.^[27][28][29] 이 경우 이미지는 스캐닝 없이 CCD 카메라로 단일 프레임으로 얻어지므로, 이 기술은 관심 물체 전반에 걸쳐 동적 과정을 동시에 시각화하는 데 특히 유용하다. 광시야 다광자 현미경을 사용하면 다광자 스캐닝 현미경에 비해 프레임 속도를 최대 1000배까지 높일 수 있다.^[28] 그러나 산란 조직에서는 깊이가 증가할수록 이미지 품질이 급격히 저하된다.

역합성곱

형광 현미경은 복잡한 환경 내에서 특수하게 표지된 구조를 보여주고 생물학적 구조의 3차원 정보를 제공하는 강력한 기술이다. 그러나 이 정보는 조명 시 모든 형광 표지된 구조가 초점에 있든 없든 빛을 방출한다는 사실로 인해 흐려진다. 따라서 특정 구조의 이미지는 항상 초점이 맞지 않는 구조에서 오는 빛의 기여로 인해 흐려진다. 이 현상은 특히 높은 분해능을 가진 대물렌즈, 일반적으로 높은 개구수를 가진 유침 대물렌즈를 사용할 때 대비 손실을 초래한다.

펄스형 테라헤르츠 레이저 이미징 시스템의 수학적으로 모델링된 점 확산 함수.^[31]

그러나 흐림은 빛 산란과 같은 무작위 과정에 의해 발생하는 것이 아니라 현미경 이미징 시스템에서 이미지 형성의 광학적 특성에 의해 잘 정의될 수 있다. 작은 형광 광원(본질적으로 밝은 점)을 고려하면, 이 점에서 나오는 빛은 점이 초점에서 멀어질수록 우리의 관점에서 더 멀리 퍼진다. 이상적인 조건에서, 이것은 세 번째 (축) 차원에서 이 점 광원의 "모래시계" 모양을 생성한다. 이 모양을 현미경 이미징 시스템의 점 확산 함수(PSF)라고 한다. 모든 형광 이미지는 이러한 많은 수의 작은 형광 광원으로 구성되어 있으므로 이미지는 "점 확산 함수에 의해 합성곱되었다"고 말한다. 테라헤르츠 레이저 펄스 이미징 시스템의 수학적으로 모델링된 PSF가 오른쪽에 나와 있다.

이미징 시스템의 출력은 다음 방정식을 사용하여 설명할 수 있다.

${\displaystyle s(x,y)=PSF(x,y)*o(x,y)+n}$

여기서 n은 가산 잡음이다.^[32] 이 점 확산 함수^[33]를 알면 일반적으로 역합성곱 현미경이라고 알려진 컴퓨터 기반 방법을 통해 이 과정을 어느 정도 역전시킬 수 있다.^[34] 2D 또는 3D 역합성곱에 사용할 수 있는 다양한 알고리즘이 있다. 이들은 크게 비복원 방법과 복원 방법으로 분류할 수 있다. 비복원 방법은 초점면에서 초점 이탈 빛을 제거하여 대비를 개선할 수 있지만, 복원 방법만이 빛을 원래의 위치로 실제로 재할당할 수 있다. 이러한 방식으로 형광 이미지를 처리하는 것은 공초점 현미경 이미지와 같이 초점 이탈 빛이 없는 이미지를 직접 획득하는 것보다 이점이 있다. 왜냐하면 그렇지 않으면 제거되었을 광 신호가 유용한 정보가 되기 때문이다. 3D 역합성곱의 경우, 일반적으로 다른 초점면에서 촬영된 일련의 이미지(Z-스택이라고 함)와 현미경의 모든 기여 매개변수를 알면 실험적으로 또는 이론적으로 도출할 수 있는 PSF에 대한 지식을 제공한다.

회절 한계 이하 기술

 이 부분의 본문은 초해상 현미경입니다.

초해상 현미경의 예. 유방암 치료제 트라스투주맙의 표적인 Her3 및 Her2의 암세포 내 이미지.

최근 회절 한계를 극복하는 다수의 초해상 현미경 기술이 개발되었다.

이는 주로 충분히 정적인 샘플을 여러 번 이미지화하고 여기광을 수정하거나 이미지의 확률적 변화를 관찰함으로써 달성된다. 이전 섹션에서 설명한 역합성곱 방법은 PSF로 인한 흐림을 제거하고 빛의 수학적으로 '정확한' 원점을 할당하는 데 사용되지만, 픽셀 값의 의미에 대한 약간 다른 이해를 바탕으로 한다. 대부분의 경우, 단일 형광단이 단일 이미지의 단일 블롭에 기여한다고 가정하면, 이미지의 블롭은 계산된 위치로 대체될 수 있으며, 해상도를 회절 한계 이하로 크게 향상시킨다.

이러한 가정을 실현하기 위해서는 형광단의 광물리학에 대한 지식과 화학적 제어가 핵심이며, 이를 통해 약 20 나노미터의 해상도를 얻을 수 있다.^[35][36]

직렬 시간 부호화 증폭 현미경

 이 부분의 본문은 직렬 시간 부호화 증폭 현미경입니다.

직렬 시간 부호화 증폭 현미경 (STEAM)은 광학 이미지 증폭을 사용하여 감도와 속도 사이의 근본적인 절충을 우회하고, 단일 픽셀 광검출기를 사용하여 검출기 배열 및 판독 시간 제한의 필요성을 제거함으로써 초고속 셔터 속도와 프레임 속도를 제공하는 이미징 방법이다.^[37] 이 방법은 최신 CCD 및 CMOS 카메라보다 최소 1000배 빠르다. 따라서 충격파, 미세유체역학, MEMS, 레이저 수술의 실시간 진단 및 평가를 포함하여 높은 이미지 획득 속도가 필요한 과학, 산업 및 생체의학 응용 분야에 잠재적으로 유용하다.^[38]

확장

대부분의 최신 기기는 마이크로 사진 및 전자적으로 이미지 기록을 위한 간단한 솔루션을 제공한다. 그러나 이러한 기능이 항상 존재하는 것은 아니며, 숙련된 현미경학자는 사진보다 손으로 그린 이미지를 선호할 수 있다. 이는 주제에 대한 지식이 있는 현미경학자가 3차원 이미지를 정확한 2차원 그림으로 변환할 수 있기 때문이다. 그러나 사진 또는 다른 이미지 캡처 시스템에서는 항상 하나의 얇은 평면만 초점이 잘 맞는다.

정확한 현미경 사진을 생성하려면 단안 접안렌즈를 사용하는 현미경 기술이 필요하다. 양쪽 눈을 모두 뜨고 현미경을 들여다보지 않는 눈은 현미경 옆 벤치에 있는 종이에 집중하는 것이 중요하다. 연습을 통해 머리나 눈을 움직이지 않고 현미경 이미지에서 연필 끝을 동시에 "보면서" 관찰된 모양을 정확하게 추적할 수 있다.

기타 향상 기능

 이 부분의 본문은 입체현미경입니다.

미세분광법: 현미경을 이용한 분광법

엑스선

 이 부분의 본문은 엑스선 현미경입니다.

해상도는 빛의 파장에 따라 달라지기 때문에 1930년대부터 빛 대신 전자빔을 사용하는 전자현미경이 개발되었다. 전자빔의 파장이 훨씬 짧기 때문에 해상도는 훨씬 높다.

흔하지는 않지만 1940년대 후반부터 엑스선 현미경도 개발되었다. 엑스선 현미경의 해상도는 광학 현미경과 전자현미경 사이이다.

전자 현미경

 이 부분의 본문은 전자현미경입니다.

회절 한계 이하 현미경이 발명되기 전까지는 빛의 파장이 전통 현미경의 해상도를 약 0.2 마이크로미터로 제한했다. 더 높은 해상도를 얻기 위해 전자현미경에서는 훨씬 작은 파장을 가진 전자빔을 사용한다.

• 투과전자현미경(TEM)은 광학 현미경과 상당히 유사하며, 시료의 매우 얇은 단면에 전자빔을 통과시킨다. 2005년 해상도 한계는 약 0.05 나노미터였고 그 이후로는 크게 증가하지 않았다.
• 주사전자현미경(SEM)은 시료 표면의 세부 사항을 시각화하고 매우 좋은 3D 뷰를 제공한다. 이는 입체 광학 현미경과 유사한 결과를 제공한다. 2011년 SEM의 최고 해상도는 0.4 나노미터였다.

엑스선분광학이 장착된 전자현미경은 정성 및 정량적인 원소 분석을 제공할 수 있다. 분석 전자현미경이라고도 알려진 이러한 유형의 전자현미경은 나노재료 연구에 매우 강력한 도구가 될 수 있다.^[39]

주사 탐침 현미경

 이 부분의 본문은 주사 탐침 현미경입니다.

이것은 회절 한계 이하 기술이다. 주사 탐침 현미경의 예로는 원자힘 현미경(AFM), 주사 터널링 현미경, 광자 힘 현미경, 재귀 추적 현미경 등이 있다. 이러한 모든 방법은 고체 탐침 팁이 거의 평평하다고 가정되는 물체의 표면을 스캔하기 위해 물리적 접촉을 사용하는 방식이다.

초음파 힘

초음파력 현미경(UFM)은 AFM 이미지가 대비가 제한적인 "평평한" 관심 영역에서 세부 사항과 이미지 대비를 개선하기 위해 개발되었다. AFM-UFM의 조합은 근거리 음향 현미경 이미지를 생성할 수 있다. AFM 팁은 초음파를 감지하는 데 사용되며 음향 현미경에서 발생하는 파장 한계를 극복한다. AFM 팁 아래의 탄성 변화를 사용하여 AFM 지형도보다 훨씬 더 상세한 이미지를 생성할 수 있다.

초음파 힘 현미경은 캔틸레버 또는 샘플에 초음파 진동을 가하여 원자력 현미경에서 탄성의 국부 매핑을 허용한다. 초음파 힘 현미경의 결과를 정량적으로 분석하기 위해 캔틸레버 베이스에 초음파 진동을 가하여 힘-거리 곡선 측정을 수행하고, 결과는 유한 차분 기술을 기반으로 하는 캔틸레버 동역학 및 팁-샘플 상호 작용 모델과 비교된다.

자외선 현미경

자외선 현미경은 두 가지 주요 목적을 가지고 있다. 첫 번째는 자외선 전자기파 에너지의 짧은 파장을 사용하여 표준 광학 현미경의 회절 한계를 넘어선 이미지 해상도를 개선하는 것이다. 이 기술은 현대 반도체와 같이 매우 작은 특징을 가진 장치의 비파괴 검사에 사용된다. 자외선 현미경의 두 번째 응용은 샘플 내의 분자와 빛의 상호 작용으로 인해 개별 샘플의 반응이 주변에 비해 향상되는 대비 향상이다. 한 가지 예는 단백질 결정의 성장이다. 단백질 결정은 염 용액에서 형성된다. 염과 단백질 결정은 모두 성장 과정에서 형성되며, 둘 다 일반적으로 사람의 눈에는 투명하기 때문에 표준 광학 현미경으로는 구별할 수 없다. 트립토판은 280 nm에서 빛을 흡수하므로 280 nm 대역통과 필터가 있는 UV 현미경으로 이미징하면 두 가지 유형의 결정을 쉽게 구별할 수 있다. 단백질 결정은 어둡게 나타나고 염 결정은 투명하다.

적외선 현미경

적외선 현미경이라는 용어는 적외선 파장에서 수행되는 현미경을 의미한다. 일반적인 장비 구성에서는 푸리에 변환 적외선 분광계(FTIR)가 광학 현미경 및 적외선 검출기와 결합된다. 적외선 검출기는 단일 지점 검출기, 선형 배열 또는 2D 초점면 배열일 수 있다. FTIR은 적외선 분광법을 통해 화학 분석을 수행할 수 있는 기능을 제공하며, 현미경과 지점 또는 배열 검출기는 이 화학 분석을 공간적으로 해결할 수 있도록 한다. 즉, 샘플의 다른 영역에서 수행할 수 있다. 따라서 이 기술을 적외선 미세분광법이라고도 한다.^[40][41] 레이저 직접 적외선 (LDIR) 이미징이라고 불리는 대체 아키텍처는 가변 적외선 광원과 이동하는 대물렌즈에 있는 단일 지점 검출기의 조합을 포함한다. 이 기술은 적외선 화학 이미징에 자주 사용되며, 여기서 이미지 대비는 특정 IR 파장에 대한 개별 샘플 영역의 반응에 의해 결정되며, 일반적으로 특정 IR 흡수 대역 및 관련 분자 공명에 의해 결정된다. 기존 적외선 미세분광법의 주요 한계는 공간 해상도가 회절 한계에 의해 제한된다는 것이다. 특히 공간 해상도는 빛의 파장과 관련된 수치로 제한된다. 실제 IR 현미경의 경우, 공간 해상도는 특정 기술 및 사용된 장비에 따라 파장의 1-3배로 제한된다. 중적외선 파장의 경우, 이는 실제 공간 해상도 한계를 약 3-30 μm로 설정한다.

회절 한계 이하 현미경의 IR 버전도 존재한다.^[40][41] 여기에는 IR 근접장 주사 광학 현미경(NSOM)^[42], 광열 미세분광법 및 원자현미경 기반 적외선 분광법(AFM-IR), 그리고 산란형 근접장 주사 광학 현미경(s-SNOM)^[43] 및 나노-FTIR이 포함되며, 이들은 IR 파장에서 나노 규모의 공간 해상도를 제공한다.

디지털 홀로그래피 현미경

DHM 위상 변화(왼쪽) 및 위상차현미경(오른쪽)으로 촬영한 인간 세포

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디지털 홀로그래피 현미경(DHM)에서 결맞는(단색) 광원으로부터의 파면 간섭은 센서에 기록된다. 이미지는 기록된 홀로그램으로부터 컴퓨터에 의해 디지털로 재구성된다. 일반적인 명시야 이미지 외에도 위상 변화 이미지가 생성된다.

DHM은 반사 모드와 투과 모드 모두에서 작동할 수 있다. 반사 모드에서 위상 변화 이미지는 상대적인 거리 측정값을 제공하므로 반사 표면의 지형 맵을 나타낸다. 투과 모드에서 위상 변화 이미지는 표본의 광학적 두께를 라벨 없이 정량적으로 측정한다. 생물학적 세포의 위상 변화 이미지는 염색된 세포 이미지와 매우 유사하며 고함량 분석 소프트웨어에 의해 성공적으로 분석되었다.

DHM의 독특한 특징은 홀로그램에 의해 모든 초점 평면이 동시에 기록되기 때문에 이미지가 기록된 후 초점을 조절할 수 있다는 점이다. 이 기능은 부피 내에서 움직이는 입자를 이미지화하거나 표면을 빠르게 스캔할 수 있게 한다. 또 다른 매력적인 특징은 DHM이 소프트웨어로 광학 수차를 보정함으로써 저렴한 광학 장치를 사용할 수 있다는 점이다.

디지털 병리학 (가상 현미경)

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디지털 병리학은 디지털 슬라이드에서 생성된 정보를 관리할 수 있게 하는 컴퓨터 기술로 구현되는 이미지 기반 정보 환경이다. 디지털 병리학은 부분적으로 가상 현미경으로 구현되는데, 이는 유리 슬라이드를 보고, 관리하고, 분석할 수 있는 디지털 슬라이드로 변환하는 작업이다.

레이저 현미경

레이저 현미경은 다양한 형태의 현미경에서 레이저 조명원을 사용하는 빠르게 성장하는 분야이다.^[44] 예를 들어, 생물학적 응용에 중점을 둔 레이저 현미경은 초단 펄스 레이저를 비선형 현미경, 포화 현미경, 두 광자 여기 현미경으로 분류되는 여러 기술에서 사용한다.^[45]

고강도, 단펄스 연구실용 엑스선 레이저는 수년간 개발되어 왔다. 이 기술이 실현되면 살아있는 상태의 기본적인 생물학적 구조를 정확히 정의된 순간에 확대된 3차원 이미지로 얻을 수 있게 될 것이다. 물과 단백질 사이의 최적 대비를 얻고 최상의 감도와 해상도를 얻기 위해서는 레이저를 약 0.3 나노미터의 질소선 근처로 조정해야 한다. 해상도는 주로 필요한 수의 광자가 등록되는 동안 발생하는 수력학적 팽창에 의해 제한될 것이다.^[46] 따라서 표본은 노출로 인해 파괴되더라도 폭발하기 전에 그 구성을 포착할 수 있다.^{[47][48][49][50][51][52]}

과학자들은 적절한 레이저의 장기적인 개발에도 불구하고 엑스선 홀로그래피 현미경의 실용적인 설계와 프로토타입에 대해 연구해왔다.^{[53][54][55][56][57][58][59][60]}

광음향 현미경

 이 부분의 본문은 광음향 현미경입니다.

사람 적혈구의 광음향 현미경 사진.

광음향 효과, 즉 빛 흡수로 인한 (초)음파 생성에 의존하는 현미경 기술이다.^[61] 초점 조절되고 강도 변조된 레이저 빔이 샘플 위를 래스터 스캔한다. 생성된 (초)음파는 초음파 변환기를 통해 감지된다. 일반적으로 압전 초음파 변환기가 사용된다.^[62]

이미지 대비는 샘플의 흡수 계수 ${\displaystyle \alpha }$와 관련이 있다. 이는 이미지 대비가 투과율 또는 산란으로 인한 밝은 시야 또는 어두운 시야 현미경과 대조적이다. 원칙적으로 형광 현미경의 대비도 샘플의 흡수에 비례한다. 그러나 형광 현미경에서는 신호를 감지하려면 형광 양자 수율 ${\displaystyle \eta _{fl}}$이 0이 아니어야 한다. 그러나 광음향 현미경에서는 모든 흡수 물질이 다음 비례하는 광음향 신호 ${\displaystyle PA}$를 제공한다.

${\displaystyle PA\propto \alpha *\Gamma *((1-\eta _{fl})*E_{g}+(E_{laser}-E_{g}))}$

여기서 ${\displaystyle \Gamma }$는 그뤼나이젠 계수이고, ${\displaystyle E_{laser}}$는 레이저의 광자 에너지이며, ${\displaystyle E_{g}}$는 샘플의 밴드갭 에너지이다. 따라서 광음향 현미경은 형광 현미경의 보완 기술로 잘 어울리는 것으로 보인다. 높은 형광 양자 수율은 높은 형광 신호로 이어지고, 낮은 형광 양자 수율은 높은 광음향 신호로 이어지기 때문이다.

비선형 효과를 무시하면 측면 해상도 dx는 아베 회절 한계에 의해 제한된다.

${\displaystyle dx=\lambda /(2*NA)}$

여기서 ${\displaystyle \lambda }$는 여기 레이저의 파장이고 NA는 대물렌즈의 개구수이다. 아베 회절 한계는 입사 파면이 평행할 때 유효하다. 그러나 실제로는 레이저 빔 프로파일이 가우스 분포를 따른다. 따라서 달성 가능한 해상도를 계산하기 위해서는 절단된 가우스 빔에 대한 공식을 사용해야 한다.^[63]

아마추어 현미경

아마추어 현미경은 생물학적 및 비생물학적 표본을 취미 목적으로 조사하고 관찰하는 것이다. 광물, 곤충, 조가비, 식물 수집가들은 현미경을 사용하여 수집품을 분류하는 데 도움이 되는 특징을 밝혀낸다. 다른 아마추어들은 연못 물이나 다른 샘플에서 발견되는 생명체를 관찰하는 데 관심이 있을 수 있다. 현미경은 가정 수족관을 키우는 사람들을 위한 수질 평가에도 유용할 수 있다. 미세 이미지의 사진 문서화 및 그림 그리기는 추가적인 즐거움이다. 현미경 사진 예술 대회가 있다. 이 취미에 참여하는 사람들은 상업적으로 준비된 미세 슬라이드를 사용하거나 자신만의 슬라이드를 준비할 수 있다.

현미경은 생물학적 표본을 문서화하는 데 중요한 도구이지만, 현미경 조사만으로 새로운 종을 설명하는 데는 종종 불충분하다. 새로운 종의 발견을 확인하기 위해서는 유전 및 생화학적 검사가 필요한 경우가 많다. 연구실과 학술 문헌에 대한 접근은 필수적이다. 그러나 아마추어가 전문가보다 가지는 한 가지 장점은 주변 환경을 탐색할 시간이다. 종종 숙련된 아마추어들은 전문가와 협력하여 자신들의 발견을 검증하고 새로운 종을 설명하기도 한다.

1800년대 후반, 아마추어 현미경은 미국과 유럽에서 인기 있는 취미가 되었다. 일부 '전문 아마추어'는 자선가들로부터 일요일 오후에 즐거움을 주기 위해 채집 여행과 현미경 탐험에 대한 보수를 받기도 했다 (예: 규조류 전문가 A. Grunow는 벨기에의 한 기업가 등으로부터 보수를 받았다). 존 핀 교수는 "현미경 선택 및 사용에 대한 실용적인 힌트 (제2판, 1878년)"를 출판했으며, "미국 현미경 저널"의 편집자이기도 했다.

아마추어 현미경 이미지의 예:

• 
  "집벌" 입 100배
• 
  쌀 줄기 CS 400배
• 
  토끼 고환 100배
• 
  양치류 전엽체 400배

법과학에서의 응용

현미경은 법과학 분야에서 응용된다.^[64] 현미경은 가장 작은 증거물을 감지, 해상하고 영상화할 수 있으며, 종종 어떤 변형이나 파괴 없이도 가능하다. 현미경은 섬유, 머리카락, 흙, 먼지 등을 식별하고 비교하는 데 사용된다.

잉크 자국, 혈흔 또는 총알의 경우, 시료 처리가 필요 없으며 현미경 검사에서 직접 증거가 나타난다. 특정 물질의 흔적의 경우, 현미경 검사 전에 시료 준비를 해야 한다.

광학 현미경은 법의학에서 가장 많이 사용되며, 광자를 사용하여 이미지를 형성한다. 법의학 표본 검사에 가장 적합한 현미경은 다음과 같다.^[65]

1. 복합 현미경

2. 비교 현미경

3. 입체 현미경

4. 편광 현미경

5. 미세분광광도계

법의학 응용 분야에서 다양한 종류의 현미경이 사용되는 주된 이유는 광학 현미경, SEM, TEM의 배율 범위가 각각 (1-1200배), (50-30,000배), (500-250,000배)이기 때문이다.^[65]

같이 보기

• 재료 분석 방법 목록
• 디지털 현미경
• 디지털 병리학
• 이미징 사이클러 현미경
• 무한대 보정
• 간섭 현미경
• 쾰러 조명
• 현미경학자 목록
• 마이크로덴시토미터
• 현미경 연대표
• 두 광자 여기 현미경
• USB 현미경
• 레이우엔훅의 현미경
• 레이우엔훅의 미생물 생명체 현미경 발견 (미생물)