De Enschedese Boys werd op 20 april 1906 opgericht door een tiental tieners onder de naam Lotisico. Een jaar later werd aansluiting gezocht bij de Twentsche Voetbalbond, waarbij de naam van de vereniging werd gewijzigd in Excelsior. In 1910 moest de club opnieuw haar naam wijzigen en werd besloten tot hernoeming in Enschedese Boys. Tevens werden de clubkleuren veranderd, van geel en zwart naar groen en wit. De ploeg speelde haar wedstrijden in het Volkspark. Later werd verhuisd naar een privéterrein van de Enschedese familie Deppenbroek. In 1946 wonnen ze bij hun eerste deelname meteen de Groninger Dagbladbeker, die dat jaar voor het eerst volgens het league-systeem gespeeld werd.
Een hoogtepunt beleefde de Enschedese Boys in 1950, toen het kampioen werd van Oost-Nederland en met Ajax, Blauw-Wit, sc Heerenveen, SV Limburgia en Maurits mocht spelen om het kampioenschap van Nederland. De thuiswedstrijd tegen Ajax trok meer dan 25.000 toeschouwers. Vanaf 1954 kwam de vereniging uit in het net gestarte betaald voetbal in Nederland. De Boys kwamen vanaf 1956 uit in de Tweede divisie. Er was sprake van een verhuizing van sportpark Deppenbroek naar het net opgeleverde Stadion Het Diekman, maar uiteindelijk werd SC Enschede de bewoner van het nieuwe stadion en ging de Enschedese Boys zijn wedstrijden spelen in het G.J. van Heekpark. In 1960 werd promotie afgedwongen naar de Eerste divisie. In het eerste elftal speelde onder andere ex-international Abe Lenstra.
In april 1965 werd besloten tot een fusie met stadgenoot SC Enschede. Het aldus gevormde FC Twente ging verder als eredivisionist, terwijl SC Enschede en de Enschedese Boys bleven bestaan als amateurvereniging. In negen jaar tijd wist de club zich op te werken van derde klasse naar hoofdklasse amateurs. Vanaf seizoen 1974/75 speelde de club op het sportcomplex Wesselerbrink-Zuid. De Enschedese Boys is in de loop der jaren langzaam afgezakt en speelt in het seizoen 2010/11 in de vierde klasse amateurs.
Op 15 augustus 2009 maakten de Twentse scheidsrechtersverenigingen bekend dat ze geen arbiters meer beschikbaar stellen voor toernooien en vriendschappelijke wedstrijden van voetbalvereniging Enschedese Boys. Dit was besloten nadat een scheidsrechter door een speler was gemolesteerd.[1] Begin november 2009 werd de boycot opgeheven, hoewel individuele scheidsrechters wel mogen weigeren een wedstrijd te fluiten.
De club kende een terugloop in leden en financiële middelen waardoor op 12 juni 2017 de algemene ledenvergadering besloot de club op te heffen.[2]