Pyrosekvensering

Pyrosekvensering er en metode for å sekvensere DNA, dvs. for å finne rekkefølgen av nukleotider i DNA. Metoden er basert på det såkalte «sequencing-by-synthesis» prinsippet. Teknologien ble utviklet av Mostafa Ronaghi på Royal Institute of Technology i Stockholm i 1996.^[1][2][3]

Detaljer

Som Sanger-sekvenseringen bruker metoden DNA-polymerase for syntesen av DNA-tråden. Forskjellen er at man kan se at DNA-polymerasen henger på enkelt nukleotider på en nysyntetisert DNA-tråd. Dette er omformet til en lysblits ved hjelp av enzymer.^[4]

Lysblitsene kan registreres, og hvert par av lysintensitet og nukleotid gir et såkalt "homopolymer run", der lengden er proporsjonal med lysintensiteten (f.eks. står paret [1,G] for enkeltnukleotiden G, og [3,A] for sekvensbiten AAA). Da lyssignaler (som blir kalt "flow verdier" i 454 pyrosekvensering) har blitt observert i en fast rekkefølge («T → A → C → G»), kan sekvensen bli lest fra alle disse parene etter de har vært knyttet sammen (se eks.)

Eksempel: Lysintensitetene for de første åtte nukleotider (T,A,C,G,T,A,C,G) gir verdier rundet til (1,0,2,2,3,0,0,1). Parene [T,1], [A,0], [C,2], [G,2], [T,3], [A,0], [C,0], [G,1] kan oversettes til sekvensen TCCGGTTTG.

På grunn av at nukleotidene er behandlet i en fast syklus, er feilmønsteret annerledes enn i Sanger sekvensering. Det kan skje at en flow verdi er høyre eller lavere enn den skulle være, noe som fører til en innsetting eller til en delesjon. En substitusjon kan bare skje når en innsetting følger direkte på en delesjon eller vice versa.

Kommersialisering

Firmaet Pyrosequencing AB i Uppsala, Sverige, kommersialiserte maskin og reagenser for å sekvensere korte biter av DNA ved bruk av pyrosekvenseringsteknikken. Pyrosequencing AB ble omdøpt til Biotage i 2003 og overtatt av Qiagen i 2008.^[5] Så ble teknologien lisensert til 454 Life Sciences. 454 utviklet en array-basert pyrosekvenseringsteknikk som ble til en plattform for DNA-sekvensering i store sammenhengder, særlig for genomsekvensering og metagenomikk. 454 er i dag eid av Roche Diagnostics.

Utvikling og Anvendelser

Pyrosekvenseringen er f.eks. brukt for å finne enkeltnukleotidpolymorfier (SNP, engelsk Single Nucleotide Polymorsphism) eller i metagenomikk. Mens metoden ikke ennå har vært brukt mye for sekvensering av hele genom på grunn av korte read lengder, blir det mer og mer et alternativ til Sanger-sekvensering. I Norge ble pyrosekvensering anvendt i prosjektet for å sekvensere torskens genom.^[6] Read lengder utviklet seg fra omtrent 100-200 basepar i den første 454 generasjonen kalt GS20 (2005) til 300-400 basepar i GS FLX (2007) og står nå på omtrent 500-600 basepar i GS FLX Titanium versjonen (2008), sammenliknet med Sanger-sekvensering som produserer read lengder på over 900 basepar.

Se også

• Bioinformatikk
• DNA
• DNA-sekvensering
• Gen
• Genetikk
• Sekvenssammenstilling