Najlepsze pytania
Chronologia
Czat
Perspektywa

Oligonukleotydy

Z Wikipedii, wolnej encyklopedii

Remove ads

Oligonukleotydy – krótkie cząsteczki DNA lub RNA, które mają szeroki zakres zastosowania, między innymi w farmacji, genetyce czy kryminalistyce. Są one powszechnie wytwarzane w laboratorium przez syntezę chemiczną na podłożu stałym i mogą być otrzymywane jako cząsteczki jednoniciowe o dowolnie określonej sekwencji, co sprawia, że są niezbędne do syntezy sztucznych genów, reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), sekwencjonowania DNA, klonowania molekularnego i sond molekularnych. W przyrodzie oligonukleotydy zazwyczaj występują jako małe cząsteczki RNA, które biorą udział w regulacji ekspresji genu poprzez mechanizm interferencji RNA (miRNA i siRNA) lub w innych procesach regulacyjnych (np. piRNA lub scRNA), lub są produktami przejściowymi degradacji większych cząsteczek kwasu nukleinowego.

Sekwencję oligonukleotydów określa liczba i rodzaj nukleotydów, które tworzą całą cząsteczkę. Długość oligonukleotydu jest zwykle oznaczana przez "-mer" (z greckiego meros, "część"). Przykładowo, oligonukleotyd składający się z sześciu nukleotydów jest heksamerem, podczas gdy złożony z 25 nukleotydów to pentakozamer, zwykle nazywany "25-merem". Oligonukleotydy łatwo wiążą się, w sposób specyficzny dla danej sekwencji, z odpowiednimi komplementarnymi oligonukleotydami DNA lub RNA, tworząc dupleksy lub, rzadziej, hybrydy wyższego rzędu.

Remove ads

Synteza

Podsumowanie
Perspektywa
Thumb
Cykl syntetyczny podczas otrzymywania oligonukleotydów metodą amidofosforynową na podłożu stałym

Syntetyczne oligonukleotydy mogą mieć budowę identyczną z naturalną lub być modyfikowane, w części fosforanowej, w pierścieniu rybozy/deoksyrybozy lub w części zasady azotowej, np. w celu uzyskania różnych efektów farmakologicznych. Modyfikacje te nadają oligonukleotydom nowe właściwości i są kluczowym elementem wykorzystania ich w terapii, np. antysensowej, jako siRNA, aptamery i in.[1][2][3]

Oligonukleotydy są syntetyzowane chemicznie zazwyczaj zautomatyzowaną metodą amidofosforynową na podłożu stałym. Synteza przebiega w kierunku 3' do 5' i polega na stopniowym dołączaniu kolejnych reszt nukleotydowych do rosnącego łańcucha. Każdy cykl obejmuje cztery reakcje chemiczne: odblokowanie grupy 5'-hydroksylowej, kondensację (dołączenie kolejnej jednostki nukleotydowej), tzw. kapowanie (trwałe zablokowanie nieprzereagowanych grup 5'-OH) i utlenianie fosforynu do fosforanu. Po każdej z nich podłoże jest przemywane rozpuszczalnikiem w celu usunięcia produktów ubocznych i nieprzereagowanych substratów[4][5]. Wydajność końcowa całej syntezy Wk wynosi[4]:

Wk = Wn × 100%
gdzie n – liczba cykli syntetycznych, Wn – średnia wydajność jednego cyklu wyrażona jako ułamek molowy

Aby uzyskać pożądany oligonukleotyd konieczne jest osiągnięcie wydajności bliskiej 100% dla każdej reakcji podczas syntezy[4]. Typowa długość syntetycznych oligonukleotydowe jest rzędu 20 nukleotydów[6], a ich maksymalna długość może wynosić do 300 nukleotydów[7]. Po syntezie usuwane są grupy blokujące, a produkt odłączany jest od podłoża, co uzyskuje się np. ogrzewając podłoże z oligonukleotydem w stężonym roztworze amoniaku. Do izolowania oraz oczyszczania uzyskanych łańcuchów oligonukleotydowych stosuje się HPLC lub elektroforezę[5].

Oligonukleotydy można też otrzymać na drodze hydrolizy (chemicznej lub enzymatycznej) kwasów nukleinowych oraz syntezy enzymatycznej[8].

Remove ads

Modyfikacje oligonukleotydów

Tworzenie stabilnych chemicznie krótkich oligonukleotydów było najwcześniejszym wyzwaniem w rozwijaniu terapii antysensowej. Oligonukleotydy o budowie naturalnej są szybko rozkładane przez nukleazy, występujące w każdym typie komórek, a ponadto, ze względu na ujemny ładunek reszt fosforanowych, słabo przenikają przez błony komórkowe. Z tego względu, aby wykorzystać oligonukleotydy do celów terapeutycznych, konieczne jest wprowadzenie modyfikacji, które zwiększają ich stabilność i lipofilowość[9][10].

Modyfikacje grupy fosforanowej

Najczęściej stosowaną modyfikacją grupy fosforanowej oligonukleotydów jest zamiana jednego z niewiążących atomów tlenu na atom siarki, a zatem zastąpienie naturalnej reszty fosforanowej resztą tiofosforanową. Jeden z niemostkowych atomów tlenu zostaje wówczas zastąpiony atomem siarki, dzięki czemu odporność na degradację enzymatyczną wzrasta o kilka rzędów wielkości. Innymi modyfikkacjami wiązania internukleotydowego są metylofosfoniany (PCH
3
), boranofosfoniany (PBH
3
), amidofosforany (PNR
2
) i in.[10]

Modyfikacje w części cukrowej

Przykładowe modyfikacje w pozycji 2', to grupy 2'-O-metylowa i 2'-O-metoksyetylowa[10].

Remove ads

Oligonukleotydy antysensowe

Oligonukleotydy antysensowe (ASO, z ang. antisense oligonucleotides) są pojedynczymi nićmi DNA lub RNA, które są komplementarne do wybranej sekwencji mRNA. Po wytworzeniu dupleksów typu RNA-DNA, nić mRNA jest degradowana przez RNazę H, wstrzymując syntezę niepożądanego białka[11].

Morfolino oligonukleotydy są grupa antysensowych oligonukleotydów, które są stosowane w biologii molekularnej do modyfikacji ekspresji genów. Ich struktura zawiera zasady DNA przyłączone do szkieletu pierścieni metylenomorfolinowych połączonych grupami fosforodiamidowymi. Zatwierdzone przez FDA leki golodirsen i eteplirsen, które są przeznaczone do leczenia DMD zawierają w swojej strukturze morfolino oligonukleotydy[12].

Techniki analityczne

Oligonukleotydy mogą być analizowane za pomocą:

Remove ads

Przypisy

Loading related searches...

Wikiwand - on

Seamless Wikipedia browsing. On steroids.

Remove ads