Кэп-анализ экспрессии генов

Кэп-ана́лиз экспре́ссии ге́нов^[1] (англ. cap analysis gene expression, CAGE) — технология, используемая в молекулярной биологии, в результате которой получают профили экспрессии генов эукариот с одновременным определением специфических для клетки/ткани условий транскрипционных стартовых сайтов (TSS), включая данные о задействованных промоторах. Метод заключается в получении и прочтении коротких (обычно длиной 27 нуклеотидов) участков последовательности 5'-конца кэпированных РНК эукариот. Далее проводится картирование секвенированных последовательностей на готовый геном, что позволяет уточнить 5'-границы транскрибируемых областей, а также провести количественный анализ экспрессии. Методика была разработана и опубликована в 2003 году, после чего активно совершенствовалась^[2]. Метод активно используется в исследовательском проекте по функциональной аннотации геномов млекопитающих (англ. FANTOM — Functional Annotation of the Mammalian Genome)^[3].

С помощью данного метода было показано существование альтернативно регулируемых сайтов начала транскрипции^[4][5] и были открыты новые регуляторные элементы^[6]. Также он позволил предсказывать сайты связывания факторов транскрипции^[7] и других мотивов, связанных с транскрипцией^[8]. Анализ 5'-концов данным методом особенно хорош для исследования регуляторных взаимосвязей генов; с его помощью выявили ключевые транскрипционные факторы, ответственные за дифференцировку монобластов в моноциты^[9]. Поскольку данный метод не предполагает никакую известную модель гена, он показал, что ретротранспозоны экспрессируются специфично и регулируют мРНК и другие некодирующие РНК^[10].

Актуальность метода

Биологический аспект

Для транскрипции необходимо, чтобы РНК-полимераза связалась с промоторной последовательностью ДНК. У бактерий за этот процесс отвечает сигма-фактор, и, как правило, инициация происходит на −10 и −35 нуклеотидов до точки начала транскрипции (σ⁷⁰ узнает консенсусные последовательности в этой области)^[11]. У архей и эукариот происходит преинициация с участием транскрипционных факторов. В зависимости от типа транскрипционного фактора инициация у эукариот может происходить в разных сайтах промоторной области до точки начала транскрипции. Кроме того, существует множество механизмов регуляции этого процесса. Например, некоторые транскрипционные факторы способны связываться со специальными регуляторными последовательностями, что приводит к активации или подавлению транскрипции целевого гена. Сложность системы инициации транскрипции затрудняет точное предсказание сайта начала транскрипции по последовательности ДНК^[12].

Секвенирование последовательностей мРНК позволяет решить эту проблему, однако используемый для поиска транскрибируемых участков RNA-seq, основанный на современных методах секвенирования с последующим картированием ридов на геном, обычно не позволяет определить четкие границы (с точностью до одного нуклеотида) концов РНК. С одной стороны, чем более протяженный участок мы можем отсеквенировать, тем проще будет собирать риды. С другой стороны, чем длиннее риды, тем меньше вероятность каждого из них попасть на край транскрипта. В результате при любой технологии секвенирования обычно возникают отклонения в количестве ридов на концах транскрибируемой области (см. рис. 1)^[13].

Для решения проблемы определения точки начала транскрипции у бактерий существуют различные методы, основанные на избирательном присоединении различных тэгов к 5'-концу мРНК с трифосфатом на конце^[14][15].

Для решения проблемы определения точки начала транскрипции у эукариот был создан метод CAGE и последующие его модификации. Он сосредоточен на секвенировании 5’-концов РНК, которые кэпированы у эукариот. У прокариот на 5'-конце вместо кэпа находится трифосфат, поэтому метод CAGE к ним применить невозможно. Однако применяется альтернативный метод: РНК обрабатывают эндонуклеазами, после чего подвергают обработке 5'-экзонуклеазами. При этом остаются только защищенные трифосфатом 5’-концевые фрагменты^[16].

Внешние изображения
Поддержка ридами участков секвенируемой РНК при RNA-seq не одинакова
	Рис. 1. Зависимость количества ридов от их положения на РНК при различных методиках RNA-seq

Технологические особенности

Сравнение методов RNA-seq и CAGE показывает, что оба метода дают почти одинаковые количественные оценки экспрессии генов^[17]. Это подтверждает высокую эффективность метода CAGE ещё и для количественного анализа экспрессии. Основное преимущество CAGE — возможность секвенирования последовательностей старта транскрипции. Данная методика неоднократно совершенствовалась и были достигнуты следующие технологические показатели^[18]:

• Малое время эксперимента (около 62 ч)
• Низкое начальное количество РНК (1 — 5 мкг)
• Возможность упрощения протоколов (можно сократить некоторые стадии эксперимента, например амплификацию с помощью ПЦР)
• Относительно небольшая стоимость (81$ за библиотеку)

Ограничения

Так как метод был изначально создан для анализа 5'-концевых участков РНК, претерпевших процесс кэпирования, с помощью него невозможно анализировать некэпированные РНК. В связи с этим метод не применим к прокариотам, а также к РНК, транскрибированных РНК-полимеразами I и III. Кроме того большинство разработанных протоколов не работают с РНК короче ~100 нуклеотидов, так как они вымываются в ходе очистки^[19].

Базовая схема эксперимента

Внешние изображения
Схема базового эксперимента
	Рис. 2. Схема базового протокола CAGE[2]

Ниже приводится схема базового эксперимента CAGE^[2][19].

1. Синтез полной кДНК обратной транскриптазой с олиго(dТ) праймером, комплементарным полиаденилированному 3’-концу мРНК. Получение полных мРНК-кДНК гибридов.
2. Биотинилирование^[англ.] 5'-конца мРНК с помощью обработки реагентом «CAP Trapper»^[20], специфично взаимодействующим с двумя соседними гидроксильными группами кэпа.
3. Очистка кэп-содержащих дуплексов с использованием стрептавидиновых носителей.
4. Гидролиз мРНК, получение одноцепочечной полной кДНК.
5. Прикрепление к 5'-концу 1-го биотинилированного линкера с сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции XmaJI и MmeI.
6. Синтез второй цепи кДНК (до сайта полиаденилирования).
7. Обработка дцДНК эндонулеазой рестрикции MmeI. Рестриктаза MmeI способна делать разрез двухцепочечной нуклеиновой кислоты, отступив 20/18 нуклеотидов. Эта её особенность используется, чтобы избавиться от большей части кДНК, сохранив примерно 20 нуклеотидов, соответствующих 5'-концу мРНК.
8. Лигирование с противоположной стороны 2-го линкера, содержащего сайт узнавания XbaI.
9. ПЦР (увеличение числа копий).
10. Обработка рестриктазами XmaJI и XbaI (получение фрагментов по 32 нуклеотида, из которых 20 — последовательность с 5'-конца мРНК).
11. Очистка стрептавидином (избавляемся от фрагментов линкеров).
12. Получение конкатемеров^[англ.] лигированием липких GATC концов, возникших после обработки рестриктазами.
13. Создание библиотеки клонов и секвенирование по Сэнгеру.
14. Картирование фрагментов на собранный геном.

Развитие технологии

Внешние изображения
Схема обновленного эксперимента
	Рис. 3. Схема нового протокола CAGE

В 2011 году, в связи с задействованием технологии в ENCODE, был переосмыслен протокол CAGE для секвенирования платформами нового поколения. Так, теперь^[21]:

• В реакции обратной транскрипции используется фермент, не имеющий рибонуклеазной активности. Обратная транскриптаза SuperScript II (РНКаза Н активность практически уничтожена мутагенезом)^[22] заменена на PrimeScript (полностью отсутствует активность РНКаза Н, кроме того хорошо работает с GC-богатой РНК и РНК с богатой вторичной структурой, обладает более высокой точностью)^[23]. В результате происходит более качественный синтез первой цепи кДНК.
• Вместо олиго(dТ) праймеров используются праймеры, содержащие случайную последовательность длиной 15 нт. Случайные праймеры были впервые предложены в 2006 году^[19] и позволяют работать с слабополиаденилированной и неполиаденилированной РНК. Также при использовании случайных праймеров эффективность транскрипции 5'-концов не зависит от длины мРНК.
• Вместо эндонуклеазы рестрикции MmeI используется EcoP15I. Эндонуклеаза EcoP15I разрезает ДНК с отступом в 27 нт от сайта узнавания, что позволяет увеличить читаемое число нуклеотидов с 20 до 27, увеличив таким образом однозначность картирования последовательностей на геном.
• Перед биотинилированием смесь обрабатывается РНКазами. Это приводит к увеличению качества очистки целевой РНК, так как экстрагируются только полные с 5'-конца РНК
• Биотинилируются как кэп, так и 3'-конец РНК.
• Одноцепочечные кДНК лигируют со специально подготовленными димерами маркированных линкеров, неспособными соединяться друг с другом.
• После лигирования кДНК с димерами линкеров смесь обрабатывают специальной фосфатазой, работающей при низких температурах Данная процедура увеличивает точность метода.
• Синтез второй цепи кДНК происходит при участии биотинилированных праймеров.
• Производится лигирование со 2-м линкером, комплеметарным 3'-концевым праймерам секвенирования.
• ПЦР (необходимый этап при создании библиотеки клонов и дальнейшего секвенирования) содержит 5'- и 3'-концевые последовательности праймеров секвенирования.

Методы, основанные на CAGE

DeepCAGE

Данный метод был разработан для нахождения малоактивных промоторов. Метод устарел по сравнению с более поздними протоколами. Для прочтения конкатемеров применяются методы 454-секвенирования «нового поколения»^[24].

nanoCAGE

Данный метод был разработан для работы с очень малыми количествами РНК (до 10 нг тотальной РНК)^[25]:

• Вместо использования реагента «CAP Trapper» применяется подход со сменой матрицы.
• Используется эндонуклеаза EcoP15I, что позволяет увеличить длины последовательностей до 27 нуклеотидов.
• Последовательности читаются напрямую на NGS-платформе Solexa (сейчас часть Illumina), что позволяет отказаться от получения конкатемеров.

CAGEscan

Данный метод является адаптацией nanoCAGE (от тех же авторов) для секвенирования спаренных концов^[25]:

• Не используется стадия ферментативного отрезания 5'-тегов.
• 5'-концы кДНК секвенируются в обе стороны, чтобы соединить данные о новых промоторах со старыми аннотациями.

HeliScopeCAGE

Данный метод был разработан для уменьшения предвзятости и предполагает использование одномолекулярного секвенирования. Протокол автоматизирован Itoh et al.^[26] в 2012 году^[6].

• Отсутствуют стадии достраивания второй цепи, лигирования и отрезания 5'-концевых участков.
• 5'-кэпированные РНК секвенируются без ПЦР с использованием платформы HeliScope (секвенирует индивидуальные молекулы).

RAMPAGE

Данный метод был разработан для профилирования активности промоторов^[27].

• Использование исходного реагента «CAP Тrapper», смена матрицы (nanoCAGE) и обработка 5′-фосфат-зависимыми экзонуклеазами совмещены для максимизации специфичности промотора.

nAnTi-CAGE

Данный метод был разработан для уменьшения предвзятости и предполагает использование Illumina^[28].

• Отсутствует стадия отрезания 5'-концевых участков последовательностей.
• 5'-кэпированные РНК секвенируются без ПЦР.

Анализ

Результатом кэп-анализа экспрессии генов является набор последовательностей секвенированных областей, следующих за сайтами старта транскрипции, и их уровень экспрессии. Граница начала транскрипции определяется с точностью до одного нуклеотида. Окружение сайта начала транскрипции обычно включают в себя регуляторные элементы, контролирующие экспрессию генов. Таким образом, становится возможным сопоставление уровня экспрессии с различных точек инициации транскрипции, выявление и анализ мотивов в прилегающих к ним областях для поиска и качественного описания энхансеров и репрессоров^[29].

Благодаря CAGE стало возможным картировать сайты стартов транскрипции и промоторы для мРНК с низким уровнем экспрессии^[29]. Также удалось доказать, что транскрипция часто начинается не строго с определённой позиции, а существует распределение: острое (где предпочтителен один старт и вариации незначительны) или широкое (когда явного пика не существует, и транскрипция может начинаться на участке в десятки и даже сотни нуклеотидов). В результате разное начало инициации транскрипции может влиять на функцию РНК/белка и открывает возможность для дополнительной регуляции^[30].

При анализе результатов CAGE надо учитывать отклонение в получаемых библиотеках в сторону добавления лишних гуанозинов на 5'-конец^[30]. Это происходит из-за проскальзывания обратной транскриптазы и даже используется в ряде протоколов, использующих «смену матрицы»^[25][31].