Флуорофор

Флуорофор (або флуорохром, подібно до хромофора ) — це флуоресцентна хімічна сполука, яка може повторно випромінювати світло під час світлового збудження. Флуорофори зазвичай містять кілька комбінованих ароматичних груп або планарних або циклічних молекул з кількома π-зв’язками. ^[1]

Мічена флуорофором клітина людини.

Флуорофори іноді використовуються окремо, як індикатори в рідинах, як барвник для фарбування певних структур, як субстрат для ферментів або як зонд чи індикатор (коли на його флуоресценцію впливають такі аспекти середовища, як полярність або іони). У більш загальному випадку вони ковалентно зв’язані з макромолекулами, слугуючи маркерами (або барвниками, або мітками, або репортерами) для афінних або біоактивних реагентів ( антитіл, пептидів, нуклеїнових кислот). Флуорофори, зокрема, використовуються для фарбування тканин, клітин або матеріалів у різноманітних аналітичних методах, таких як флуоресцентне зображення та спектроскопія.

Флуоресцеїн через його аміноактивну ізотіоціанатну похідну флуоресцеїн ізотіоціанат (FITC) був одним із найпопулярніших флуорофорів. Від мічення антитіл застосування поширилося на нуклеїнові кислоти завдяки карбоксифлуоресцеїну. Іншими історично поширеними флуорофорами є похідні родаміну (TRITC), кумарину та ціаніну. ^[2] Новіші покоління флуорофорів, багато з яких є запатентованими, часто працюють краще, будучи більш фотостабільними, яскравішими або менш чутливими до рН, ніж традиційні барвники з порівнянним збудженням і випромінюванням. ^{[3] [4]}

Флуоресценція

Флуорофор поглинає світлову енергію певної довжини хвилі та повторно випромінює світло з більшою довжиною хвилі. Поглинені довжини хвилі, ефективність передачі енергії та час до випромінювання залежать як від структури флуорофора, так і від його хімічного середовища, оскільки молекула у своєму збудженому стані взаємодіє з навколишніми молекулами. Довжини хвилі максимального поглинання (≈ збудження) і випромінювання (наприклад, поглинання/випромінювання = 485 нм/517 нм) є типовими термінами, що використовуються для позначення даного флуорофора, але весь спектр може бути важливим для розгляду. Спектр довжини хвилі збудження може бути дуже вузькою або ширшою смугою, або весь спектр може перевищувати межу. Спектр випромінювання зазвичай гостріший, ніж спектр збудження, і має більшу довжину хвилі та, відповідно, меншу енергію. Енергія збудження коливається від ультрафіолетового до видимого спектра, а енергія випромінювання може тривати від видимого світла до ближньої інфрачервоної області.

Основними характеристиками флуорофорів є:

• Максимальна довжина хвилі збудження та випромінювання (виражена в нанометрах (нм)): відповідає піку в спектрах збудження та випромінювання (зазвичай по одному піку в кожному).
• Молярний коефіцієнт поглинання (у моль ^-1 см ^-1 ): пов'язує кількість поглиненого світла на даній довжині хвилі з концентрацією флуорофора в розчині.
• Квантовий вихід : ефективність енергії, що передається від падаючого світла до випромінюваної флуоресценції (кількість випущених фотонів на поглинений фотон).
• Тривалість життя (у пікосекундах): тривалість збудженого стану флуорофора до повернення в основний стан. Це стосується часу, необхідного для розпаду популяції збуджених флуорофорів до 1/ e (≈0,368) від початкової кількості.
• Стоксів зсув : різниця між максимальною довжиною хвилі збудження та максимальною емісією.
• Темна фракція : частка молекул, неактивних у випромінюванні флуоресценції. Для квантових точок тривала одномолекулярна мікроскопія показала, що 20-90% усіх частинок ніколи не випромінюють флуоресценцію. ^[5] З іншого боку, кон’юговані полімерні наночастинки (Pdots) майже не демонструють темної фракції у своїй флуоресценції. ^[6] Флуоресцентні білки можуть мати темну фракцію через неправильне згортання білка або дефектне утворення хромофора. ^[7]

Ці характеристики обумовлюють інші властивості, включаючи фотовідбілювання або фотостійкість (втрата флуоресценції при постійному збудженні світлом). Необхідно враховувати й інші параметри, як-от полярність молекули флуорофора, розмір і форму флуорофора (тобто для картини поляризаційної флуоресценції ) та інші фактори можуть змінити поведінку флуорофорів.

Флуорофори також можна використовувати для гасіння флуоресценції інших флуоресцентних барвників або для передачі їх флуоресценції на навіть довших хвилях.

Більшість флуорофорів є невеликими органічними молекулами з 20–100 атомів (200–1000 Дальтон ; молекулярна маса може бути вищою залежно від модифікацій щеплення та кон’югованих молекул), але є також набагато більші природні флуорофори, які є білками : зелений флуоресцентний білок (GFP) становить 27 кДа, а кілька фікобіліпротеїнів (PE, APC...) мають ≈240 кДа. Станом на 2020 рік найменший відомий флуорофор вважався 3-гідроксіізонікотинальдегідом, сполукою з 14 атомів і лише 123 Да. ^[8]

Флуоресцентні частинки, як квантові точки (2–10 діаметр нм, 100–100 000 атомів) також вважаються флуорофорами. ^[9]

Розмір флуорофора може стерично перешкоджати міченій молекулі та впливати на полярність флуоресценції.

Сім'ї

Флуоресценція різних речовин під ультрафіолетовим світлом. Зелений — флуоресцеїн, червоний — родамін В, жовтий — родамін 6G, синій — хінін, фіолетовий — суміш хініну та родаміну 6 г. Розчини мають концентрацію приблизно 0,001% у воді.

Молекули флуорофора можуть бути використані окремо або служити флуоресцентним мотивом функціональної системи. На основі молекулярної складності та синтетичних методів молекули флуорофора можна загалом класифікувати на чотири категорії: білки та пептиди, невеликі органічні сполуки, синтетичні олігомери та полімери та багатокомпонентні системи. ^{[10] [11]}

Флуоресцентні білки GFP, YFP і RFP (зелений, жовтий і червоний відповідно) можуть бути приєднані до інших специфічних білків з утворенням злитого білка, який синтезується в клітинах після трансфекції відповідного плазмідного носія.

Небілкові органічні флуорофори належать до наступних основних хімічних груп:

• Похідні ксантена : флуоресцеїн, родамін, орегонський зелений, еозин і техаський червоний
• Похідні ціаніну : ціанін, індокарбоціанін, оксакарбоціанін, тіакарбоціанін і мероціанін
• Похідні скварейну та кільцезаміщені скварейни, включаючи барвники Seta та Square
• Похідні скварейну ротаксану(інші мови) : див. Тау-барвники
• Похідні нафталіну (похідні дансилу і продану(інші мови) )
• Похідні кумарину
• Похідні оксадіазолу : піридилоксазол, нітробензоксадіазол і бензоксадіазол
• Похідні антрацену : антрахінони, включаючи DRAQ5, DRAQ7 і CyTRAK Orange
• Похідні пірену : каскадний синій(інші мови) та ін.
• Похідні оксазину : нільський червоний, нільський блакитний, крезиловий фіолетовий, оксазин 170(інші мови) та ін.
• Похідні акридину : профлавін, акридиновий оранжевий, акридиновий жовтий та ін.
• Похідні арилметину : аурамін, кристалічний фіолетовий, малахітовий зелений
• Похідні тетрапіролу : порфін, фталоціанін, білірубін
• Похідні дипіррометену: BODIPY, аза-BODIPY

Ці флуорофори флуоресцюють завдяки делокалізованим електронам, які можуть стрибати через смугу та стабілізувати поглинену енергію. Наприклад, бензол, один із найпростіших ароматичних вуглеводнів, збуджується при 254 нм і випромінює на 300 нм. ^[12] Це відрізняє флуорофори від квантових точок, які є флуоресцентними наночастинками напівпровідника.

Вони можуть бути приєднані до білків до певних функціональних груп, таких як аміногрупи ( активний ефір, карбоксилат, ізотіоціанат, гідразин ), карбоксильні групи ( карбодиімід ), тіол ( малеімід, ацетилбромід ) і органічний азид (через клацальну хімію або не- зокрема ( глутаровий альдегід )).

Крім того, можуть бути присутні різні функціональні групи, що змінюють їхні властивості, наприклад розчинність, або надають особливі властивості, наприклад борна кислота, яка зв’язується з цукрами, або кілька карбоксильних груп для зв’язування з певними катіонами. Якщо барвник містить електронодонорну та електроноакцепторну групи на протилежних кінцях ароматичної системи, цей барвник, ймовірно, буде чутливим до полярності навколишнього середовища ( сольватохромний ), тому його називають чутливим до середовища. Часто барвники використовуються всередині клітин, які непроникні для заряджених молекул; в результаті цього карбоксильні групи перетворюються в складний ефір, який видаляється естеразами всередині клітин, наприклад, фура-2АМ і флуоресцеїн-діацетат.

Наступні родини барвників є групами торгових марок і не обов’язково мають структурну подібність.

• CF барвник (біотій)
• Зонди DRAQ і CyTRAK ( BioStatus )
• BODIPY ( Invitrogen )
• EverFluor (Setareh Biotech)
• Alexa Fluor (Invitrogen)
• Bella Fluor (Setareh Biotech)
• DyLight Fluor (Thermo Scientific, Pierce)
• Атто і Трейсі ( Сігма Олдріх )
• FluoProbes ( Інтерхім )
• Барвники Abberior (Абберіор)
• Барвники DY та MegaStokes (Dyomics)
• Барвники Sulfo Cy (Cyandye)
• HiLyte Fluor (AnaSpec)
• Барвники Seta, SeTau і Square (SETA BioMedicals)
• Барвники Quasar і Cal Fluor ( Biosearch Technologies )
• Барвники SureLight ( APC, RPE PerCP, Phycobilisomes ) (Columbia Biosciences)
• APC, APCXL, RPE, BPE (Phyco-Biotech, Greensea, Prozyme, Flogen)
• Vio Dyes (Miltenyi Biotec)

Ядра ендотеліальних клітин легеневої артерії великої рогатої худоби пофарбовані в синій колір за допомогою DAPI, мітохондрії пофарбовані в червоний колір за допомогою MitoTracker Red CMXRos і F-актин пофарбовані в зелений колір за допомогою фаллоідіну Alexa Fluor 488 і зображені на флуоресцентному мікроскопі.

Приклади часто зустрічаються флуорофорів

Реактивні та кон'юговані барвники

Dye	Ex (nm)	Em (nm)	MW	Notes
Hydroxycoumarin	325	386	331	Succinimidyl ester
Aminocoumarin	350	445	330	Succinimidyl ester
Methoxycoumarin	360	410	317	Succinimidyl ester
Cascade Blue(інші мови)	(375);401	423	596	Hydrazide
Pacific Blue	403	455	406	Maleimide
Pacific Orange	403	551
3-Hydroxyisonicotinaldehyde	385	525	123	QY 0.15; pH sensitive
Lucifer yellow	425	528
NBD	466	539	294	NBD-X
R-Phycoerythrin (PE)	480;565	578	240 k
PE-Cy5 conjugates	480;565;650	670		aka Cychrome, R670, Tri-Color, Quantum Red
PE-Cy7 conjugates	480;565;743	767
Red 613	480;565	613		PE-Texas Red
PerCP	490	675	35kDa	Peridinin chlorophyll protein
TruRed	490,675	695		PerCP-Cy5.5 conjugate
FluorX	494	520	587	(GE Healthcare)
Fluorescein	495	519	389	FITC; pH sensitive
BODIPY-FL	503	512
G-Dye100	498	524		suitable for protein labeling and electrophoresis
G-Dye200	554	575		suitable for protein labeling and electrophoresis
G-Dye300	648	663		suitable for protein labeling and electrophoresis
G-Dye400	736	760		suitable for protein labeling and electrophoresis
Cy2	489	506	714	QY 0.12
Cy3	(512);550	570;(615)	767	QY 0.15
Cy3B	558	572;(620)	658	QY 0.67
Cy3.5	581	594;(640)	1102	QY 0.15
Cy5	(625);650	670	792	QY 0.28
Cy5.5	675	694	1272	QY 0.23
Cy7	743	767	818	QY 0.28
TRITC	547	572	444	TRITC
X-Rhodamine	570	576	548	XRITC
Lissamine Rhodamine B(інші мови)	570	590
Texas Red	589	615	625	Sulfonyl chloride
Allophycocyanin (APC)	650	660	104 k
APC-Cy7 conjugates	650;755	767		Far Red

Скорочення:

• Ex (нм): довжина хвилі збудження в нанометрах
• Em (нм): довжина хвилі випромінювання в нанометрах
• MW: Молекулярна маса
• QY: Квантовий вихід

Нуклеїнові кислотні барвники

Dye	Ex (nm)	Em (nm)	MW	Notes
Hoechst 33342	343	483	616	AT-selective
DAPI	345	455		AT-selective
Hoechst 33258	345	478	624	AT-selective
SYTOX Blue	431	480	~400	DNA
Chromomycin A3	445	575		CG-selective
Mithramycin	445	575
YOYO-1	491	509	1271
Ethidium Bromide	210;285	605	394	in aqueous solution
GelRed	290;520	595	1239	Non-toxic substitute for Ethidium Bromide
Acridine Orange	503	530/640		DNA/RNA
SYTOX Green	504	523	~600	DNA
TOTO-1, TO-PRO-1	509	533		Vital stain, TOTO: Cyanine Dimer
TO-PRO: Cyanine Monomer
Thiazole Orange(інші мови)	510	530
CyTRAK Orange	520	615	-	(Biostatus) (red excitation dark)
Propidium Iodide (PI)	536	617	668.4
LDS 751	543;590	712;607	472	DNA (543ex/712em), RNA (590ex/607em)
7-AAD	546	647		7-aminoactinomycin D, CG-selective
SYTOX Orange	547	570	~500	DNA
TOTO-3, TO-PRO-3	642	661
DRAQ5	600/647	697	413	(Biostatus) (usable excitation down to 488)
DRAQ7	599/644	694	~700	(Biostatus) (usable excitation down to 488)

Барвники для функції клітин

Барвник	Ex (нм)	Em (нм)	МВт	Примітки
Індо-1	361/330	490/405	1010	Естер AM, низький/високий вміст кальцію (Ca 2+ )
Флуо-3	506	526	855	AM естер. pH > 6
Флуо-4	491/494	516	1097	AM естер. pH 7,2
DCFH	505	535	529	2'7'Дихородигідрофлуоресцеїн, окислена форма
DHR	505	534	346	Дигідрородамін 123, окислена форма, світло каталізує окислення
SNARF	548/579	587/635		pH 6/9

Флуоресцентні білки

Dye	Ex (nm)	Em (nm)	MW	QY	BR	PS	Notes
GFP (Y66H mutation)	360	442
GFP (Y66F mutation)	360	508
EBFP	380	440		0.18	0.27		monomer
EBFP2	383	448			20		monomer
Azurite	383	447			15		monomer
GFPuv	385	508
T-Sapphire	399	511		0.60	26	25	weak dimer
Cerulean	433	475		0.62	27	36	weak dimer
mCFP	433	475		0.40	13	64	monomer
mTurquoise2	434	474		0.93	28		monomer
ECFP	434	477		0.15	3
CyPet	435	477		0.51	18	59	weak dimer
GFP (Y66W mutation)	436	485
mKeima-Red	440	620		0.24	3		monomer (MBL)
TagCFP	458	480			29		dimer (Evrogen)
AmCyan1	458	489		0.75	29		tetramer, (Clontech)
mTFP1	462	492			54		dimer
GFP (S65A mutation)	471	504
Midoriishi Cyan	472	495		0.9	25		dimer (MBL)
Wild Type GFP	396,475	508	26k	0.77
GFP (S65C mutation)	479	507
TurboGFP	482	502	26 k	0.53	37		dimer, (Evrogen)
TagGFP	482	505			34		monomer (Evrogen)
GFP (S65L mutation)	484	510
Emerald	487	509		0.68	39	0.69	weak dimer, (Invitrogen)
GFP (S65T mutation)	488	511
EGFP	488	507	26k	0.60	34	174	weak dimer, (Clontech)
Azami Green	492	505		0.74	41		monomer (MBL)
ZsGreen1	493	505	105k	0.91	40		tetramer, (Clontech)
TagYFP	508	524			47		monomer (Evrogen)
EYFP	514	527	26k	0.61	51	60	weak dimer, (Clontech)
Topaz	514	527			57		monomer
Venus	515	528		0.57	53	15	weak dimer
mCitrine	516	529		0.76	59	49	monomer
YPet	517	530		0.77	80	49	weak dimer
TurboYFP	525	538	26 k	0.53	55.7		dimer, (Evrogen)
ZsYellow1	529	539		0.65	13		tetramer, (Clontech)
Kusabira Orange	548	559		0.60	31		monomer (MBL)
mOrange	548	562		0.69	49	9	monomer
Allophycocyanin (APC)	652	657.5	105 kDa	0.68			heterodimer, crosslinked
mKO	548	559		0.60	31	122	monomer
TurboRFP	553	574	26 k	0.67	62		dimer, (Evrogen)
tdTomato	554	581		0.69	95	98	tandem dimer
TagRFP	555	584			50		monomer (Evrogen)
DsRed monomer	556	586	~28k	0.1	3.5	16	monomer, (Clontech)
DsRed2 ("RFP")	563	582	~110k	0.55	24		(Clontech)
mStrawberry	574	596		0.29	26	15	monomer
TurboFP602	574	602	26 k	0.35	26		dimer, (Evrogen)
AsRed2	576	592	~110k	0.21	13		tetramer, (Clontech)
mRFP1	584	607	~30k	0.25			monomer, (Tsien lab)
J-Red	584	610		0.20	8.8	13	dimer
R-phycoerythrin (RPE)	565 >498	573	250 kDa	0.84			heterotrimer[13]
B-phycoerythrin (BPE)	545	572	240 kDa	0.98			heterotrimer[13]
mCherry	587	610		0.22	16	96	monomer
HcRed1	588	618	~52k	0.03	0.6		dimer, (Clontech)
Katusha	588	635			23		dimer
P3	614	662	~10,000 kDa				phycobilisome complex[13]
Peridinin Chlorophyll (PerCP)	483	676	35 kDa				trimer[13]
mKate (TagFP635)	588	635			15		monomer (Evrogen)
TurboFP635	588	635	26 k	0.34	22		dimer, (Evrogen)
mPlum	590	649	51.4 k	0.10	4.1	53
mRaspberry	598	625		0.15	13		monomer, faster photobleach than mPlum
mScarlet	569	594		0.70	71	277	monomer[14]

Скорочення:

• Ex (нм): довжина хвилі збудження в нанометрах
• Em (нм): довжина хвилі випромінювання в нанометрах
• MW: Молекулярна маса
• QY: Квантовий вихід
• BR: Яскравість: молярний коефіцієнт поглинання * квантовий вихід / 1000
• PS: фотостабільність : час [сек] для зменшення яскравості на 50%

Додатки

Докладніше: Флуоресценція в біологічних дослідженнях

Флуорофори мають особливе значення в галузі біохімії та дослідження білка, наприклад, в імунофлуоресценції, клітинному аналізі, ^[15] імуногістохімії ^{[3] [16]} і датчиках малих молекул. ^{[17] [18]}

Використання поза науками про життя

Флуоресцентний морський барвник

Флуоресцентні барвники знаходять широке застосування в промисловості під назвою «неонові кольори», такі як:

• Розширені косметичні формули
• Засоби захисту та одяг
• Органічні світлодіоди (OLED)
• Образотворче мистецтво та дизайн (плакати та живопис)
• Використання багатотонних накипів у фарбуванні текстилю та оптичних відбілювачів у пральних засобах
• Барвники в хайлайтерах для створення ефекту блиску
• Сонячні панелі для збору більшої кількості світла/довжин хвиль

• Флуоресцентний морський барвник використовується, щоб допомогти повітряним пошуково-рятувальним командам знаходити об'єкти у воді

Дивіться також

• Категорія:Флуоресцентні барвники
• Флуоресценція в біологічних дослідженнях
• Гасіння флуоресценції
• Відновлення флуоресценції після фотовідбілювання (FRAP) – програма для кількісного визначення рухливості молекул у ліпідних подвійних шарах.