Komplementarna DNK

U genetici, komplementarna DNK (cDNK) je DNK sintetizirana iz jednolančane RNK, npr. informacijska RNK (iRNK) ili mikroRNK (miRNK), predložak u reakciji koju katalizira enzim reverzna transkriptaza. cDNK se često koristi za kloniranje eukariotskih gena u prokariotima. Kada se želi eksprimirati određeni protein u ćeliji koja ga obično ne izražava (tj. heterologno ispoljava), prenijet će cDNK, koja kodira protein u ćeliju primatelja. U molekulskoj biologiji, cDNK se također generira za analizu transkriptomakog profila u rasutom tkivu, pojedinačnim ćelijama ili pojedinačnim jedrima. Koristi se u testovima kao što su mikromreže (mreže segmenata DNK poznate sekvence koja se upotrebljava za testiranje i mapiranje fragmenata DNK, antitela ili proteina) i RNK-sekv .

Ispoljavanje cDNK na DNK mikromreži u testiranju

Komplementarna DNK se također prirodno proizvodi u retrovirusima (poput HIV-1, HIV-2, majmunskom virusu imunodiferencijacije, itd.), a zatim se integrira u genom domaćina, gdje stvara provirus.^[1]

Također se koristi i termin cDNK, obično u bioinformatičkom kontekstu, kada se odnosi na transkripcijske sekvence iRNK, izražene kao baze DNK (deoksi-GCAT), a ne baze RNK (GCAU).

Sinteza

RNK služi kao predložak za sintezu cDNK.^[2] U ćelijskim organizmima, cDNK generiraju virusi i retrotranspozoni za integraciju RNK u ciljnu genomsku DNK. U molekulskoj biologiji, RNK se prečišćava iz izvornog materijala, nakon uklanjanja genomske DNK, proteina i drugih ćelijskih komponenata. Tatim se cDNA sintetizira putem in vitro obrnute transkripcije.^[3]

Prečišćavanje RNK

RNK se transkribira iz genomske DNK u ćelijama domaćina i ekstrahiranjem pomoću liziranja ćelija, a zatim prečišćava, koristeći široko korištene metode kao što su fenol-hloroform, kolona silicijevog dioksida i kuglični etodi ekstrakcije RNK.^[4] Metodi ekstrakcije variraju ovisno o izvornom materijalu. Naprimjer, za ekstrakciju RNK iz biljnog tkiva potrebni su dodatni reagensi, poput polivinilpirolidona (PVP), za uklanjanje fenolnih spojeva, ugljikohidrata i drugih spojeva koji bi RNK učinili neupotrebljivom.^[5] Za uklanjanje DNK i proteina koriste se enzimi kao što su DNaza i proteinaza K za razgradnju.^[6] Važno je da se integritet RNK održava inaktivacijom RNaza sa haotropnim agensima, kao što su gvanidinij- izotiocijanat, natrij-dodecil sulfat (SDS), fenol ili hloroform. Ukupna RNK se zatim odvaja od ostalih ćelijskih komponenata i taloži alkoholom. Postoje razni komercijalni paketi za jednostavno i brzo ekstrahiranje RNK za određene primjene.^[7] Dodatni metodi zasnovani na zrncima/kuglicama mogu se koristiti za izolaciju određenih podtipova RNK (npr. iRNK i mikroRNK) na osnovu veličine ili jedinstvenih regiona RNK.^[8][9]

Obrnuta transkripcija

Sinteza prvog lanca

Korištenjem enzima reverzna transkriptaza i prečišćenih obrazaca RNK, stvara se jedna nit cDNK (sinteza prve niti cDNK). Obično se koristi M-MLV reverzna transkriptaza iz Moloneyedvog virusa mišje leukemije, zbog svoje smanjene aktivnosti RNKaze H pogodne za transkripciju dužih molekula RNK.^[10] AMV-reverzna transkriptaza iz virusa mijeloblastoze ptica, također se može koristiti za predloške RNA s jakim sekundarnim strukturama (tj. visokom temperaturom topljenja).^[11] Komplementarna DNK se obično generira iz iRNK, za analize ekspresije gena. kao što su RT-qPCR i RNK-sekv.^[12] Informacijska RNK se selektivno prepisuje obrnuto pomoću prajmera oligo-dT, koji su reverzni komplementi poliadeniliranih repova na 3 'kraju svih iRNK. Optimizirana smeša oligo-dT i slučajnih heksamernih prajmera povećava šansu za dobijanje cDNK pune dužine, istovremeno smanjujući pristranost 5 'ili 3'.^[13] Ribosomska RNK također može biti osiromašena, kako bi obogatila i iRNK i nepoli-adenilirane transkripte, kao što su neke nekodirajuće RNK.^[14]

Sinteza drugog lanca

Rezultat sinteze prvog lanca, hibridni kompleks RNK-DNK, može se obraditi višestrukim metodima sinteze drugog lanca ili izravno u nizvodnim testovima.^[15][16] Rani metod poznat kao sinteza ukosnicom, temeljila se na stvaranju ukosnice na 3 'kraju cDNK prvog lanca, da bi se sintetizirala druga nit. Međutim, temeljni premaz je slučajan, a hidroliza ukosnice dovodi do gubitka podataka. Gublerov i Hoffmanov postupak koristi E. coli RNazu H za nabiranje iRNK, koja je zamijenjena DNK-polimeraze E. coli I i njena završna DNK-ligaza. Optimizacija ovog postupka oslanja se na nisku aktivnost RNKaze H M-MLV da dobije iRNK s preostalom RNK, koja se kasnije uklanja dodavanjem RNaze H, nakon translacije DNK polimeraze cDNK drugog lanca. Ovo sprečava informacije o izgubljenim sekvencama na 5' kraju iRNK.

Primjena

Komplementarna DNK često se koristi u kloniranju gena ili kao genska sonda ili u stvaranju bibloteka cDNK. Kada se prenesu gen iz jedne ćelije u drugu kako bi eksprimirali novi genetički materijal kao protein u ćeliji primatelja, cDNK će se dodati primatelju (umjesto cijelom genu), jer DNK za cijeli gen može uključivati DNK koja ne kodira protein ili koja prekida kodirajuću sekvencu proteina (npr. introne). Djelimične sekvence cDNK se često dobijaju kao oznaka eksprimirane sekvence

Uz pojačavanje sekvenci DNK putem lančane reakcije polimeraze (PCR), koja je danas uobičajena, obično se provodi obrnuta transkripcija kao početni korak, nakon čega slijedi PCR da bi se dobio tačan slijed cDNK za unutarćelijsku ekspresiju. To se postiže dizajniranjem DNK specifičnih sekvenci za sekvence koje se hibridiziraju na 5 'i 3' krajeva cDNA regije koja kodira protein. Jednom pojačana, sekvenca se na svakom kraju može rezati nukleazama i umetnuti u jednu od mnogih malih kružnih sekvenci DNK, poznatih kao ekspresijski vektori. Takvi vektori omogućavaju samokopiranje unutar ćelija i potencijalnu integraciju u DNK domaćina. Tipično sadrže i snažni promotor koji pokreće transkripciju ciljne cDNK u iRNK, koja se zatim prevodi u protein.

Dana 13. juna 2013. godine, Vrhovni sud Sjedinjenih Država presudio je u slučaju "Udruženje za molekularnu patologiju" protiv Myriad Genetics da, iako se ljudski geni u prirodi ne mogu patentirati, cDNA je prihvatljiva za jer se ne javlja prirodno.^[17]

Komplementarna DNK se također koristi za proučavanje ekspresije gena metodima poput RNK-sekv ili RT-qPCR.^[18][19][20] Za sekvenciranje, svaka RNK mora biti fragmentirana zbog ograničenja veličine platforme za sekvenciranje. Pored toga cDNK sintetizirana drugim lancem mora se povezati adapterima koji omogućavaju PCR-pojačavanje cDNK fragmenata i vezanje za ćelijske protočne ćelije. Metodi analize specifične za gene obično koriste mikromreže i RT-qPCR za kvantifikaciju nivoa cDNK, pomoću fluorometrijskih i drugih metoda.

Virusi i retrotranspozoni

Neki virusi također koriste cDNK, da pretvore svoju virusnu RNK u iRNK (virusna RNK → cDNK → iRNK). Za stvaranje virusnih proteina koristi se iRNK, koji preuzimaju ćeliju domaćina.

Primjer ovog prvog koraka od virusne DNK do cDNK može se vidjeti u ciklusu infekcije HIV-om. Ovdje ćelijska membrana domaćina veže se za lipidnu ovojnicu virusa, koja omogućava stvaranje virusne kapside s dvije kopije RNK virusnog genoma da uđe u domaćina. Kopija cDNK zatim se pravi putem obrnute transkripcije virusne RNK, što je postupak olakšan šaperonom CypA i reverznom transkriptazom povezanom sa virusnom kapsidom.^[21]

Komplementarna DNK također generira retrotranspozone u eukariotskim genomima. Retrotranspozoni su mobilni genetički elementi, koji se sami kreću unutar, a ponekad i između genoma putem intermedijera RNK. Ovaj mehanizam dijeli se s virusima, isključujući stvaranje zaraznih čestica.^[22][23]

Također pogledajte

• Biblioteka cDNK
• RNK-Sekv
• PCR u realnom vremenu
• PCR