Glykoproteiny

Glykoproteiny jsou proteiny s navázanými sacharidy. Proces, kterým se tyto sacharidy na protein navazují, se označuje glykosylace. Jedná se o jednu z možných posttranslačních modifikací proteinů. Termín „glykoprotein“ by neměl být zaměňován s proteoglykany a peptidoglykany.

Schéma stavby glykoproteinu

Biosyntéza

Glykosylace probíhá převážně v endoplazmatickém retikulu a v Golgiho aparátu. Podle typu vazby, kterou jsou sacharidy na proteiny navázány, dělíme glykoproteiny na N-glykoproteiny, O-glykoproteiny a nově také C-glykoproteiny a fosfoglykoproteiny. Enzymy katalyzující přenos a navázání sacharidů na proteiny se nazývají obecně glykosyltransferázy (např. galaktosyltransferáza – enzym přenášející galaktózu).

Kromě specifického, řízeného připojování sacharidů na proteiny může v organismu docházet i k nespecifickým, spontánním dějům – tzv. glykacím. Na rozdíl od glykosylací nespecifické glykace mohou poškodit funkci proteinů. Nespecifické glykace jsou problémem hlavně u lidí s cukrovkou, kteří při nedodržování diety trpí zvýšenou hladinou glukózy v krvi.

Glykoproteiny jsou typické hlavně pro eukaryota, nicméně glykosylované proteiny jsou známé i u prokaryot (převážně O-glykosylace).^[1][2]

Skupiny glykoproteinů

Sacharidy jsou na protein vázány glykosidovou vazbou. Glykosidová vazba je speciální označení acetálové vazby u sacharidů. Sacharidy tvoří stabilní cyklické poloacetaly (reakcí jejich karbonylové skupiny s některou –OH na konci jejich řetězce), které jsou dále schopné reagovat s –OH nebo –NH₂ skupinami (proteinů, jiných sacharidů, nukleotidových bází, ...) za tvorby acetalů.^[3]

N-glykoproteiny

Oligosacharidy jsou vázány N-glykosidickou vazbou jsou na asparagin v sekvenci Asn-Xaa-Ser/Thr (kde Xaa může být jakákoliv aminokyselina kromě prolinu). K N-glykosylacím dochází v drsném endoplazmatickém retikulu během syntézy proteinu. Sacharidy se přenáší na protein en block (v kuse) v podobě tetradekasacharidu, který je pak dále v endoplazmatickém retikulu a Golgiho aparátu upravován. Důležitou roli v syntéze N-vázaných oligosacharidů hraje dolichol, izoprenoidní látka zakotvená v membráně endoplazmatického retikula, která slouží jako přenašeč sacharidů při syntéze.^[4]

U prokaryot také můžeme nalézt N-glykoproteiny, proces syntézy je obdobný eukaryotickému.^[5]

• přehled N-vázaných oligosacharidů (N-glykanů)
• 
  základní N-glykan (syntetizovaný v ER)
• 
  komplexní (laktosaminový)typ N-glykanu
• 
  manózový typ N-glykanu
• 
  hybridní typ N-glykanu
• 
  vzorec základního N-glykanu
• 
  3D model základního N-glykanu

O-glykoproteiny

O-glykoproteiny jsou proteiny, které mají připojené sacharidy na –OH skupinách svých serinů / threoninů. K O-glykosylaci dochází převážně v jednotlivých oddílech Golgiho aparátu. Sacharidy jsou připojovány na protein postupně ( na rozdíl od N-vázaných oligosacharidů) bez dolicholového prekurzoru

• mucinový typ – nejrozšířenější typ O-glykoproteinů u savců. Muciny a podobné proteiny jsou sekretovány sliznicemi. Muciny často obsahují velké množství navázaných sacharidů (až 50% (w/w)) většinou ve formě kratších oligosacharidů. Základem je vždy α-N-acetylgalaktosamin (α-GalNAc) navázaný na serin nebo threonin. Nebyla definována žádná specifická sekvence, která by rozhodovala o tom, který serin nebo threonin bude glykosylován, nicméně tyto seriny/theroniny se nalézají v oblastech bohatých na serin, threonin, alanin a prolin. Dalším rozhodujícím faktorem jsou sekundární a terciární struktury.

• proteoglykanový typ (O-xylosylace) – další rozšířenou skupinou proteinů s O-vázanými polysacharidy jsou proteoglykany. Proteoglykany tvoří podstatnou složku extracelulární hmoty a sekretů sliznic. Sacharidovou složkou jsou často kyselé polysacharidy typu heparansulfát, chondroitinsulfát apod. Prvním krokem glykosylace proteoglykanů je přidání β-xylosy na serin/threonin, který je vzápětí rozšířen na oligosacharid:GlcAβ(1-3)Galβ(1-3)Galβ(1-4)Xylβ-Ser. K tomuto oligosacharidu jsou opakovaně přidávány další monosacharidy (N-acetylglukosamin (GlcNAc) a glukuronová kyselina (GlcA). Takto nasyntetizovaný polysacharidový řetězec je dále upravován (N-deacetylace, epimerizace GlcA na kyselinu idunoronovou a O- a N- sulfatace).^[6]

xylosa

• O-fukosylace – nově objevená O-glykosylace, která na rozdíl od ostatních neprobíhá v Golgiho aparátu, ale v endoplazmatickém retikulu.^[7]

• O-GlcNAc glykosylace – vazba N-acetylglukosaminu (GlcNAc) na serin nebo threonin, na který už se většinou další sacharidy nevážou. Objevením tohoto typu glykosylace byla popřena dvě dogmata glykobiochemie: k O-GlcNAc glykosylaci dochází na rozdíl od ostatních glykosylací v cytoplasmě a jádře a O-GlcNAc není statickou modifikací, ale podobně jako fosforylace / defosfoylace proteinů slouží k rychlému ovlivnění funkce některých proteinů. Tento typ glykosylace se může podílet na regulaci transkripčních aktivit, enzymatických aktivit, ochraně před degradací proteinů proteasomem, nukleárním transportu.^[8]

• O-manosylace ^[9]

C-glykoproteiny

C-glykoproteiny jsou poměrně nově objevená skupina glykoproteinů u savců, ve kterých je _D-manosa navázaná C-glykosidovou vazbou na C-2 uhlík tryptofanu, který je v sekvenci Trp-Xaa-Trp. K úpravě dochází v endoplazmatickém retikulu a donorem manosy je dolichol-manosa (viz N-glykopreteiny). Role C-glykosylace je doposud nejasná.^[10]

Fosfoglykoproteiny

Fosfoglykoproteiny zahrnují několik skupin proteinů, které mají na připojený sacharid na Thr / Ser proteinu přes fosfodiesterovou vazbu. Tento typ glykosylace zatím nebyl nalezen u savců, což ji činí potenciálním cílem pro vývoj nových léků.^[11]

Využívané sacharidy

Využívané sacharidy v glykoproteinech

Sacharidy využívané v biosyntéze (včetně glykosylací) nejsou většinou používány přímo, ale teprve po navázání na nukleotidové přenašeče. Tyto přenašeče jsou různé pro jednotlivé sacharidy.

tabulka nukleotidových přenašečů sacharidů

UDP	GDP	CMP
glukóza	manóza	sialové kyseliny
N-acetylglukosamin	L-fukóza	-
galaktóza	-	-
N-acetylgalaktosamin	-	-
xylóza	-	-

• příklady nukleotidových přenašečů s navázanými sacharidy
• 
  UDP-glukóza
• 
  GDP-manóza
• 
  CMP-kyselina neuraminová (Sia)

Funkce

Sacharidy v glykoproteinech mají různé funkce, jako například:

• interakce leukocytů s endotheliem kapilár v místě infekce
• vznik rezervoáru spermií ve vejcovodu
• degradace nesprávně sbalených proteinů v endoplazmatickém retikulu pomocí N-vázaných polymanosových oligosacharidů.^[12]

Studium glykoproteinů

Detekce glykoproteinů

• metoda dle Duboise – obecná metoda stanovení sacharidů založená na dehydrataci sacharidů kyselinou sírovou za vzniku furfuralů a jejich následná kondenzace s fenolem, která dává vzniknout žlutohnědému produktu, jehož koncentrace (odpovídající koncentraci původního sacharidu / sacharidů se dá spektrofotometricky stanovit.
• specifické barvení glykoproteinů v polyakrylamidovém gelu – proteiny jsou rozděleny pomocí SDS elektroforézy (SDS-PAGE), získaný polyakrylamidový gel se inkubuje v roztoku kyseliny jodisté, která oxiduje sacharidové složky glykoproteinů na dialdehydy. Ty pak v následujícím kroku redukují Ag⁺. Glykoproteiny se objeví jako hnědé proužky.
• lektinové studie – lektiny (proteiny, které jsou schopné specificky rozpoznávat a vázat určité mono- nebo oligosacharidy) se nechají zreagovat s proteiny. Jejich navázání je důkazem přítomnosti určitých (pro daný lektin specifických) sacharidových struktur.

Sekvenace oligo- a polysacharidů

Na rozdíl od proteinů nebo nukleových kyselin tvoří sacharidy často větvené polymery, což výrazně komplikuje určování struktur. Navíc každý sacharid poskytuje většinou 5-6 míst (-OH skupin), na které se mohou další sacharidy vázat. Pro určení, které hydroxylové skupiny jsou v oligo/polysacharidu volné se používá methylačích činidel, která nespecificky methylují tyto –OH skupiny. Po hydrolýze a rozdělení na jednotlivé monosacharidy se určí, které –OH skupiny se účastní vazeb a které jsou volné Pro pořadí jednotlivých monosacharidů se využívá různých exoglykosidas (enzymů, které odštěpují sacharidy od vnějšího konce směrem k proteinu)

Studium protein-sacharidových interakcí

• Metoda ELBA – analogie k metodě ELISA. Na dno polystyrenových mikrotitračních destiček se připevní glykoprotein (nebo oligosacharid / polysacharid), pak se k němu přidá zkoumaný předem biotinylovaný protein, o němž se předpokládá, že by mohl rozpoznávat sacharidovou část glykoproteinu. Po promytí, pokud došlo k interakci, zůstává biotinylový protein přichycen, což se vizualizuje pomocí avidin-peroxidázy (nebo avidin-alkalické fosfatázy). Během inkubace zkoumaných látek (glykoproteinu a biotinylovaného proteinu) se může do inkubační směsi přidat například monosacharid/ oligosacharid a sleduje se případná inhibice interakce.
• Western blot
• Použití glykosidáz a glykosyltransferáz – pomocí těchto skupin enzymů se modifikují sacharidové složky glykoproteinů a sleduje se vliv těchto modifikací na dané protein-sacharidové interakce (zesílení, zeslabení, objevení, vymizení)