Hybrydyzacja northern

Hybrydyzacja northern (ang. northern blot) – stosowana w biologii molekularnej metoda służąca do detekcji określonych sekwencji nukleotydów w RNA. Najczęściej stosuje się ją do wykrywania mRNA pochodzących z genów ulegających transkrypcji w komórce. Technika została opracowana przez Jamesa Alwine’a, Davida Kempa i George’a Starka z Uniwersytetu Stanforda w 1977 roku^[1]. Nazwa metody jest grą angielskich słów z nazwą wcześniejszej metody wykrywania sekwencji DNA, zwanej (od nazwiska twórcy, Edwina Southerna) hybrydyzacją Southerna (ang. southern – południowy; northern – północny).

Metodyka

Schemat procedury metody northern

Procedura rozpoczyna się od izolacji RNA z materiału biologicznego (może to być np. zhomogenizowana tkanka, kultura komórkowa, izolowane organelle). Zależnie od eksperymentu można użyć całkowitego RNA lub oczyszczonej frakcji poli(A), która zawiera jedynie poliadenylowane RNA. W drugim podejściu próbka jest wzbogacona w cząsteczki mRNA w porównaniu z całkowitym RNA (gdzie ilościowo przeważają cząsteczki rRNA i tRNA), co pozwala na badanie genów o niskim poziomie ekspresji. Oczyszczanie frakcji poli(A) można przeprowadzić np. z użyciem celulozy z trwale związanym kwasem oligotymidynowym – oligo(dT)^[2].

Wyizolowany RNA poddaje się rozdziałowi elektroforetycznemu w warunkach denaturujących. Stosowane czynniki denaturujące to np. mieszanina glioksalu z DMSO^[3][4], formaldehyd^[5], formamid lub mocznik^[6]. Współcześnie najszerzej stosowane są żele agarozowe z dodatkiem formaldehydu albo poliakrylamidowe z dodatkiem mocznika. Te ostatnie pozwalają na rozdzielenie mniejszych cząsteczek RNA, stąd są używane przy detekcji tzw. małych RNA (ang. small RNAs np. siRNA, miRNA)^[7].

Kolejnym etapem jest transfer RNA na membranę. W zależności od użytej metody rozdziału stosuje się transfer kapilarny (do żeli agarozowych) albo transfer w polu elektrycznym (do żeli poliakrylamidowych). Transfer kapilarny prowadzi się podobnie jak w metodzie Southerna – żel układa się na arkusz papieru filtracyjnego zanurzony w rezerwuarze roztworu do transferu, na żel kładzie się membranę (nitrocelulozową^[3] lub nylonową^[8]), którą pokrywa się kilkoma arkuszami papieru filtracyjnego i stosem suchych, papierowych ręczników. Na koniec całą konstrukcję przyciska się równomiernie ok. półkilogramowym obciążnikiem. Transfer prowadzi się zwykle kilkanaście godzin (12-16 h). Za transport odpowiadają siły kapilarne. Roztwór migruje pionowo od naczynia przez żel i membranę do papierowych ręczników, a wraz z nim wędrują cząsteczki RNA. Transfer w polu elektrycznym (analogiczny do stosowanego w metodzie western) stosuje się w przypadku żeli poliakrylamidowych. Przepływ prądu powoduje przeniesienie ujemnie naładowanych cząsteczek RNA z żelu na membranę.

RNA ulega adsorpcji na membranie dzięki oddziaływaniom hydrofobowym. Utrwalenie kwasów nukleinowych na membranie (po zakończeniu transferu) osiąga się przez wypiekanie w wysokiej temperaturze (dla membran nitrocelulozowych) lub naświetlanie lampą UV^[9] (dla membran nylonowych), co prowadzi do utworzenia wiązań kowalencyjnych między cząsteczkami kwasu nukleinowego a grupami funkcyjnymi na powierzchni membrany. Proces utrwalania jest znany w żargonie pod angielską nazwą cross-linking.

Ocena jakości RNA na membranie i efektywności transferu jest możliwa dzięki barwieniu roztworem błękitu metylenowego^[10].

Tak przygotowaną membranę umieszcza się w roztworze prehybrydyzacyjnym (blokowanie membrany), a następnie hybrydyzacyjnym – zawierającym sondę hybrydyzacyjną. Może nią być odcinek DNA lub RNA o sekwencji komplementarnej do wykrywanego fragmentu RNA. Sondę należy wcześniej wyznakować, by możliwa była jej detekcja. Najpopularniejsze są sondy znakowane radioaktywnie (izotopem ³⁵P), używa się również sond znakowanych biotyną lub digoksygeniną^[11]. Po etapie hybrydyzacji membranę płucze się w celu usunięcia nadmiaru niezwiązanej sondy. Detekcję radioaktywnych sond prowadzi się z użyciem klisz fotograficznych. Sondy nieradioaktywne wykrywa się za pomocą streptawidyny (o bardzo silnym powinowactwie do biotyny) lub przeciwciał przeciwko digoksygeninie skoniugowanych z fluoroforem lub peroksydazą chrzanową (detekcja analogiczna do metody western)^[12].

Zastosowania metody

Głównym zastosowaniem metody northern jest analiza ekspresji genów na poziomie RNA. Przez odpowiednie zaprojektowanie sondy można uzyskać informacje o m.in. wielkości danego transkryptu i jego prekursorów^[13], produktach pośrednich splicingu^[14], czy jego względnej ilości w komórce. Dzięki temu można porównać profil ekspresji wybranych genów w poszczególnych tkankach^[15][16], na różnych etapach rozwoju^[16] lub zmiany ekspresji pod wpływem różnych czynników (na przykład stresu środowiskowego^[17], leków^[18], zakażenia patogenem).