Trp operon

trp operon je grupa gena koji se transkribiraju zajedno, kodirajući enzime koji u bakterijama proizvode aminokiselinu triptofan. trp operon je prvi put okarakterisan u Escherichia coli, a od tada je otkriven u mnogim drugim bakterijama.^[1] Operon je reguliran tako da, kada je triptofan prisutan u okolini, geni za sintezu triptofana su potisnuti.

Struktura trp operona

"trp" operon sadrži pet strukturnih gena: trpE, trpD, trpC, trpB i trpA, koji kodiraju enzime potrebne za sintezu triptofana. Također sadrži represivni regulatorski gen koji se zove trpR. Kada je prisutan triptofan, protein trpR se vezuje za operator, blokirajući transkripciju trp operona pomoću RNK-polimeraze.

Ovaj operon je primjer represivne negativne regulacije ekspresije gena. Represorski protein vezuje se za operator u prisustvu triptofana (potiskujući transkripciju) i oslobađa se iz operona kada je triptofan odsutan (omogućava transkripcija za nastavak). Operaon trp dodatno koristi slabljenje za kontrolu ekspresije operona, drugog kontrolnog mehanizma negativne povratne sprege.

trp operon je dobro proučen i obično se koristi kao primjer regulacije gena u bakterijama uz lac operon.

Geni

Trp operon sadrži pet strukturnih gena. Njihove uloge su:

• TrpE (P00895): Antranilat-sintaza proizvodi antranilat.
• TrpD (P00904): Sarađuje sa TrpE.
• TrpC (P00909): Fosforibozilantranilat-izomeraza domen prvo pretvara N-(5-fosfo-β-D-ribozil)antranilat u 1-(2-karboksifenilamino)-1-deoksi-D- ribuloza 5-fosfat. Indol-3-glicerol-fosfat sintaza na istom proteinu zatim pretvara proizvod u (1S,2R)-1-C-(indol-3-il)glicerol 3-fosfat.
• TrpA (P0A877), TrpB (P0A879): dvije podjedinice triptofan sintetaze. Kombinira TrpC-ov proizvod sa serinom za proizvodnju triptofana.

Represija

Trp represor dimer vezan za DNK operatora

Operon djeluje putem mehanizma negativne povratne sprege. Represor za trp operon proizvodi se uzvodno od strane trpR gena, koji je konstitutivno eksprimiran na niskom nivou. Sintetizirani trpR monomeri povezuju se u dimere. Kada je triptofan prisutan, ovi triptofanski represorni dimeri vezuju se za triptofan, uzrokujući promjenu konformacije represora, omogućavajući represoru da se veže za operator. Ovo sprečava RNK-polimerazu da se veže i transkribuje operon, tako da se triptofan ne proizvodi iz njegovog prekursora. Kada triptofan nije prisutan, represor je u svojoj neaktivnoj konformaciji i ne može da veže region operatora, tako da represor ne inhibira transkripciju.

Atenuacija

Mehanizam slabljenja transkripcije "trp" operona.

Prigušivanje je drugi mehanizam negativne povratne sprege u trp operonu. Sistem represije cilja na unutarćelijsku koncentraciju trp-a, dok slabljenje reaguje na koncentraciju nabijene tRNK^trp.^[2] Dakle, trpR represor smanjuje ekspresiju gena mijenjajući inicijaciju transkripcije, dok atenuacija to čini mijenjanjem procesa transkripcije koji je već u toku.^[2] Dok TrpR represor smanjuje transkripciju za faktor od 70 , slabljenje ga može dalje smanjiti za faktor od 10, čime se omogućava akumulirana represija od oko 700 puta.^[3] Slabljenje je omogućeno činjenicom da u prokariotima (koji nemaju jedro), ribosomi počinju prevođenje iRNK dok RNK-polimeraza još uvijek transkribuje sekvencu DNK. Ovo omogućava da proces prevođenja direktno utiče na transkripciju operona.

Na početku transkribovanih gena trp operona nalazi se sekvenca od najmanje 130 nukleotida koji se naziva vodeći transkript (trpL; P0AD92).^[4] Lee i Yanofsky (1977) otkrili su da je efikasnost atenuacije u korelaciji sa stabilnošću sekundarne strukture ugrađene u trpL,^[5] a 2 sastavne ukosničke strukture terminatora kasnije su razjasnili Oxender et al. (1979).^[6] Ovaj transkript uključuje četiri kratke sekvence označene sa 1–4, od kojih je svaka djelimično komplementarna sljedećoj. Tako se mogu formirati tri različite sekundarne strukture (ukosnice): 1–2, 2–3 ili 3–4. Hibridizacija sekvenci 1 i 2, kako bi se formirala struktura 1-2 je rijetka jer RNK-polimeraza čeka da se ribosom pričvrsti prije nego što nastavi transkripciju nakon sekvence 1; međutim, ako bi se formirala ukosnica 1–2, spriječila bi stvaranje 2–3 struktura (ali ne 3–4). Formiranje ukosnice između sekvenci 2–3 sprečava stvaranje ukosnica između 1–2 i 3–4. Struktura 3–4 je transkripcijskaa terminacijska sekvenca (obiluje G/C i odmah praćena sa nekoliko ostataka uracila), nakon što se formira, RNK-polimeraza će se odvojiti od DNK i transkripcije strukturnih gena operona se ne mogu pojaviti (vidi dolje za detaljnije objašnjenje). Funkcionalni značaj 2. ukosnice za terminaciju transkripcije ilustruje smanjena frekvencija terminacije transkripcije uočena u eksperimentima koji destabilizuju centralno G+C uparivanje ove ukosnice.^[5][7][8][9]

Dio vodećeg transkripta kodira kratki polipeptid od 14 aminokiselina, zvani vodeći peptid. Ovaj peptid sadrži dva susjedna ostatka triptofana, što je neobično, budući da je triptofan prilično neuobičajena aminokiselina (otprilike jedan od stotinu ostataka u tipskom proteinu "E. coli" je triptofan). Lanac 1 u trpL obuhvata regiju koja kodira zadnje ostatke vodećeg peptida: Trp, Trp, Arg, Thr, Ser;^[2] uočena je konzerviranost u ovih 5 kodona, dok mutiranje uzvodnih kodona nije promijenilo ekspresiju operona.^{[2][10][11][12]} Ako ribosom pokuša da prevede ovaj peptid dok su nivoi triptofana u ćeliji niski, on će se zaustaviti na jednom od dva trp kodona. Dok je u zastoju, ribosom fizički štiti sekvencu transkripta1, sprečavajući formiranje 1–2 sekundarne strukture. Sekvenca 2 se tada može slobodno hibridizirati sa sekvencom 3 kako bi formirala strukturu 2–3, koja tada sprječava formiranje 3–4 terminacijske ukosnice, zbog čega se struktura 2–3 naziva antiterminacijskom ukosnicom. U prisustvu strukture 2–3, RNK-polimeraza je slobodna da nastavi sa transkripcijom operona. Mutacijska analiza i studije koje uključuju komplementarne oligonukleotide pokazuju da stabilnost strukture 2–3 odgovara nivou ekspresije operona l.^{[10][13][14][15]} Ako su nivoi triptofana u ćeliji visoki, ribosom će prevesti ceo vodeći peptid bez prekida i samo će se zaustaviti tokom završetka translacije na stop kodonu. U ovom trenutku ribosom fizički štiti obje sekvence, i 1 i 2. Sekvence 3 i 4 su stoga slobodne da formiraju strukturu 3–4 koja završava transkripciju. Ova struktura terminatora formira se kada nijedan ribosom ne stane u blizini Trp tandema (tj. Trp ili Arg kodona): ili vodeći peptid nije preveden ili se translacija odvija glatko duž lanca 1 sa obilnim nabijenim tRNKtrp.^[10][2] Štaviše, predlaže se da ribosom blokira samo oko 10 nt nizvodno, tako da ribosom zastaje u uzvodnom Gly ili dalje nizvodnom Thr ne utiče na formiranje završne ukosnice.^[2][10] Krajnji rezultat je da će operon biti transkribovan samo kada triptofan nije dostupan za ribosom, dok je trpL transkript konstitutivno izražen.

Ovaj mehanizam atenuacije je eksperimentalno podržan. Prvo, direktno je dokazano da su translacija vodećeg peptida i zastoj ribosoma neophodni za inhibiciju terminacije transkripcije.^[13] Štaviše, analiza mutacije koja destabilizuje ili ometa uparivanje baza antiterminatorske ukosnice dovodi do povećanog završetka nekoliko nabora; u skladu s modelom atenuacije, ova mutacija ne uspijeva ublažiti slabljenje čak i sa izgladnjelim Trp.^[10][13] Nasuprot tome, komplementarni oligonukleotidi koji ciljaju lanac 1 povećavaju ekspresiju operona podsticanjem formiranje antiterminatora.^[10][14] Nadalje, u histidinskom operonu, kompenzacijska mutacija pokazuje da je sposobnost uparivanja niti 2–3 važnija od njihove primarne sekvence u inhibiciji slabljenja.^[10][15]

U atenuaciji, gdje se translacijski ribosom zaustavlja, određuje da li će se formirati ukosnica za završetak.^[10] Da bi transkribirajuća polimeraza istovremeno uhvatila alternativnu strukturu, vremenska skala strukturne modulacije mora biti uporediva na transkripciju.^[2] Da bi se osiguralo da se ribosom veže i započne translaciju vodećeg transkripta odmah nakon njegove sinteze, u trpL sekvenci postoji mjesto za pauzu. Kada stigne na ovo mjesto, RNK-polimeraza pauzira transkripciju i očigledno čeka da počne translacija. Ovaj mehanizam omogućava sinhronizaciju transkripcije i translacije, što je ključni element u atenuaciji.

Sličan mehanizam slabljenja (atenuacije) reguliše sintezu histidina, fenilalanina i treonina.

Regulacija trp operona u Bacillus subtilis

Trp operonski geni raspoređeni su istim redoslijedom u E. coli i Bacillus subtilis.^[16] Regulacija trp operona u oba organizma zavisi od količine trp u ćeliji. Međutim, primarna regulacija biosinteze triptofana u B. subtilis je putem atenuacije, a ne potiskivanja, transkripcije.^[17] U B. subtilis, triptofan se vezuje za jedanaest podjedinica triptofanom aktiviranog RNK-vezujućeg proteina atenuacije (TRAP), koji aktivira sposobnost TRAP-a da se veže za trp vodeću RNK.^[18][19] Vezivanje trp-aktiviranog TRAP-a za vodeću RNK rezultira formiranjem terminatorske strukture koja uzrokuje završetak transkripcije.^[17]