Белковински домен

Белковински домен е сочуван дел од дадена белковинска низа и третична структура, кој може да постои, функционира и еволуира независно од остатокот на белковинската молекула. Секој домен формира компактна тридимензионална структура, која често е независно стабилна и независно може да се склопи. Голем број на белковини се изградени од неколку структурни домени, а еден ист домен може да се јави во структурата на мноштво различни белковини. Со рекомбинација на неколку домени во повеќе различни аранжмани можат да се добијат белковини со сосема различни функции. Големината на белковинските домени може да варира од 50 до 250 аминокиселини.^[1] Најкратките домени, како што се цинковите прсти (анг. zinc fingers) се стабилизирани од метални јони или дисулфидни мостови. Често домените формираат функционални единици, како што е EF рака (анг. EF hand) доменот кој врзува калциум и е составен дел на калмодулинот. Поради нивната независна стабилност, домените можат да се пренесат од една на друга белковинска молекула, по пат на генетски инженериг, и така да се создадат фузиони (химерни) белковини.

Пируват киназа, белковина со три домени (PDB: 1PKN ).

Историја

Ветлауфер (Wetlaufer) прв го предложил концептот на белковински домен во 1973 година, по рендгенско кристалографски проучувања на лизозим^[2] и папаин^[3] и проучувања со ограничена протеолиза на имуноглобулини.^[4][5] Ветлауфер го доминирал белковинскиот домен како стабилна единица на белковинска структура која може самостојно да се склопи. Во минатото домените биле опишувани како единици на:

• компактна структура
• функција и еволуција^[6]
• склопување (анг. folding).^[7]

Секоја од овие дефиниции е валидна и често можат да се поклопуваат, на пример, компактен структурен домен кој се среќава кај повеќе разновидни белковини, најверојатно е способен да се склопува независно во рамките на своето структурно опкружување. Во природата често се среќаваат т.н. мултидоменски и мултифункционални белковини, кои содржат повеќе од еден домен во својата структура, а често можат да вршат и повеќе од една функција.^[8] Кај мултидоменските белковини, секој домен може самостојно да ја изврши својата функција, или пак на синхронизиран начин со неговите соседни домени. Домените можат да служат или како модули за изградба на поголеми агрегати, како што се вирусните честички и мускулни влакна, или за обезбедување на специфични каталитички или врзувачки места, како што се среќава кај ензимите и регулаторните белковини.

Пример: пируват киназа

Соодветен пример е пируват киназата (види слика погоре), гликолитичен ензим кој игра важна улога во регулирање на флуксот од фруктоза-1,6-бисфосфат до пируват. Тој содржи нуклеотид-врзувачки домен изграден само од β-плочи (сино), домен за врзување на супстрат со α/β структура (сиво) и регулационен домен со α/β структура (маслиново зелена)^[9] поврзани преку неколку полипептидни линкери.^[10] Секој од домените на оваа белковина се класифицира во неколку различни белковински фамилии.^[11]

Централниот домен, кој го врзува супстратот, има структура на α/β-цилиндар и е еден од најчестите ензимски склопови.^[12] α/β-цилиндарот често се нарекува TIM цилиндар (анг. TIM barrel, именуван по ензимот триоза фосфат изомераза, каде првпат бил откриен).^[13] Моментално, TIM цилиндарот се класифицира во 26 хомологни фамилии во CATH базата на податоци (анг. CATH protein structure database). TIM цилиндарот е формиран од низа на β-α-β мотиви, која се затвора така што првата и последната полипептидна верига водородно се поврзуваат меѓусебно, со што се формира структура која личи на буре изградено од осум вериги. Еволутивното потекло на овој домен сè уште е тема на дебата. Според една студија, еден ензим предок дивергирал во неколку белковински фамилии,^[14] додека според друга студија структурата на TIM цилиндарот еволуирала неколкупати во историјата на живиот свет преку конвергентна еволуција.^[15]

TIM цилиндарот во пируват киназата е „дисконтинуиран“, што значи дека потребен е повеќе од еден сегмент од полипептидот за да се формира структурата на доменот. Ова веројатно е резултат на вметнување на еден домен во друг во текот на еволуцијата на белковината. Од досега познатите белковински структури може да се заклучи дека околу четвртина од сите структурни домени се дисконтинуирани.^[16] Вметнатиот домен на β-цилиндар во пируват киназата е „континуиран“, што значи дека го создава континуирана полипептидна низа.

Единици на белковинска структура

Главна статија: Структура на белковините

Првичната структура на една белковина (аминокиселинската низа) ја кодира неговата склопена тридимензионална (3D) конформација.^[17] Најважниот фактор кој го регулира склопувањето на белковината во нејзината 3Д-структура е дистрибуцијата на поларните и неполарните странични радикали.^[18] Склопувањето го покренува ориентацијата на хидрофобните странични радикали кон внатрешноста на молекулата, за да избегнат контакт со вода. Општо земено, белковините имаат јадро од хидрофобни аминокиселински остатоци опкружено со обвивка од хидрофилни остатоци. Бидејќи самите пептидни врски се поларни по карактер, тие се неутрализираат со меѓусебно поврзување со водородни врски кога се наоѓаат во хидрофобната средина. Ова доведува до тоа да одредени региони на полипептидот формираат чести 3D структурни форми наречени вторични структури. Постојат два главни типа на вторична структура: α-завојница и β-плоча.

Некои едноставни комбинации на елементи на вторичната структура често се јавуваат во 3D структурите на белковините и се нарекуваат супервторична структура или мотиви. На пример, мотивот β-шнола (анг. β-hairpin) се состои од две соседни антипаралелни β-нишки поврзани со мала петелка. Овој мотив се јавува кај повеќето антипаралелни β-структури, или како изолирана лента или во состав на посложените β-плочи. Друга честа супервторична структура е β-α-β мотивот, кој често се користи за поврзување на две паралелни β-нишки. Централната α-завојница го поврзува C-крајот на првата нишка со N-крајот на втората нишка, а неговите странични остатоци се скапувани спроти β-плочата, на тој начин штитејќи ги хидрофобните остатоци од β-плочата од контакт со вода.

Ковалентната асоцијација на два домена има структурна и функционална предност, бидејќи стабилноста значително се зголемува во споредба со истите домени кога не се ковалентно поврзани.^[19] Други предности се заштита на меѓупроизводите на ензимската реакција во рамките на интердоменските пукнатини на ензимската молекула, кои инаку може да бидат нестабилни во водена средина, и фиксен стехиометриски сооднос на ензимската активност неопходна за одвивање на низа реакции.^[20]

Структурното порамнување е важна алатка за одредување на белковинските домени.

Третична структура

Неколку мотиви можат да бидат спакувани заедно за да формираат локална, компактна, полунезависна единица наречена домен. Севкупната 3D структура на полипептидниот синџир се нарекува третична структура на белковината. Домените се основните единици на третичната структура, така што секој домен содржи поединечно хидрофобно јадро изградено од вторични структурни единици поврзани со петелки. Пакувањето на полипептидот обично е појако во внатрешноста отколку во надворешноста на доменот, што резултира со поцврсто јадро и пофлуидна површина.^[21] Аминокиселинските остатоци на јадрото често се сочувани во рамките на белковинската фамилија, додека остатоците на петелките се помалку сочувани, освен ако не се вклучени во функцијата на белковината. Третичната структура на белковините може да се подели на четири основни класи врз основа на содржината на вторични структури во доменот.^[22]

• Исклучиво-α домени имаат јадро изградено само од α-завојници. Во оваа класа доминираат малите склопови, од кои повеќето формираат едноставен сноп од завојници кои се насочени нагоре и надолу.
• Исклучиво-β домени имаат јадро изградено само од антипаралелни β-плочи, обично две плочи спакувани една спроти друга. Различни шеми може да се идентификуваат во распоредот на нишките, што честопати води до идентификација на повторувачки мотиви, како што е мотивот „грчки клуч“.^[23]
• α + β домените се мешавина на исклучиво-α и исклучиво-β домените. Класификацијата на белковините во оваа класа е тешка поради тешкото разграничување од другите три класи и затоа не се користи во CATH базата на податоци.
• α/β домените се составени од комбинација на β-α-β мотиви, кои претежно формираат паралелна β-плоча опкружена со амфипатични α-завојници. Вторичните структури се аранжирани во слоеви или цилиндри (буриња).

Граници во големината

Постојат граници во големината на домените.^[24] Големината на поединечните структурни домени варира од 36 аминокиселински остатоци кај Е-селектин, до 692 остатоци кај липооксигеназа-1, но мнозинството на домени (90%) имаат помалку од 200 остатоци,^[25] со просек од околу 100 остатоци.^[26] Многу кратките домени, со помалку од 40 остатоци, често биваат стабилизирани со помош на метални јони или дисулфидни врски. Големите домени, со повеќе од 300 остатоци, често содржат повеќе од едно хидрофобно јадро.^[27]

Четвртична структура

Голем број на белковини поседуваат четвртична структура, која се состои од неколку полипептидни синџири асоцирани во олигомерна молекула. Секој полипептиден синџир во таква белковина се нарекува подединица. Хемоглобинот, на пример, се состои од две α и две β подединици. Секој од овие четири полипептидни синџири има исклучиво-α глобински склоп, со жлеб за врзување на хемот.

Размена на домен (анг. domain swapping) е механизам за формирање на олигомерни агрегати.^[28] Кај размена на домен, вторичен или третичен елемент на мономерната белковина се заменува со ист елемент од друга белковина. Размена на домените може да варира од елементи на вторичната стуктура до цели структурни домени. Таа, исто така, претставува еволуционен модел за функционална адаптација преку олигомеризација, на пример, олигомерни ензими кај кои актвното место е на интерфејсите на подединиците.^[29]

Белковински домени како еволуциони модули

Природата новите низи ги прилагодува од претходно постоечки низи, а не ги создава одново.^[30] Природата често ги користи домените за создавање на нови низи; тие можат да се сметаат за генетски мобилни единици наречени „модули“. Честопати, C- и N-краевите на домените се просторно блиски, овозможувајќи им лесно да бидат вметнати во други структури за време на еволуцијата. Многу фамилии на домени се заеднички за сите три суперцарства на животот, археи, бактерии и еукариоти.^[31][32][33] Белковинските модули се подгрупа на белковински домени кои се среќаваат кај белковини со разновидни структури. Примери можат да се најдат кај вонклеточните белковини поврзани со коагулација, фибринолиза, комплемент, вонклеточната матрица, адхезиони молекули на клеточната површина и цитокински рецептори.^[34] Четири конкретни примери за широко распространети белковински модули се следните домени: SH2, имуноглобулин, фибронектин тип 3 и кринглскиот домен.

Молекуларната еволуција доведува до појава на фамилии на сродни белковини со слична аминокиселинска низа и структура. Сепак, сличностите меѓу низите можат да бидат исклучително ниски, дури и кај белковините кои ја имаат истата структура. Белковинските структури можат да бидат слични поради дивергенција од заеднички предок. Алтернативно, некои склопови (анг. folds) можат да бидат фаворизирани во однос на другите, бидејќи тие претставуваат стабилни аранжмани на вторични структури, а некои белковини можат да конвергираат кон создавање на вакви склопови во текот на еволуцијата. Досега има околу 110,000 експериментално утврдени белковински 3D структури, складирани во PDB (анг. Protein Data Bank – банка на податоци за белковини).^[35] Сепак, оваа бројка вклучува многу слични или идентични структури. Сите белковини треба да бидат класифицирани во структурни фамилии за да се разберат нивните еволуциони односи. Споредувањата на структурите на белковините најдобро се изведуваат на ниво на домени. Поради оваа причина развиени се мноштво на алгоритми кои автоматски одредуваат домени во белковините со позната 3D структура.

Базата на податоци CATH ги класифицира домените во околу 800 фамилии на склопови (анг. fold families); десет од нив се исклучително чести и се нарекуваат супер-склопови (анг. super-folds). Супер-склоповите се дефинираат како склопови за кои постојат најмалку три структури без значителна сличност во низите.^[36] Најчестиот супер-склоп е α/β-цилиндар супер-склопот (анг. α/β-barrel super-fold).

Мултидоменски белковини

Мнозинството на познати белковини, околу 2/3 кај едноклеточните организми и повеќе од 80% кај животинските организми, се мултидоменски белковини.^[37] Сепак, други истражувања заклучиле дека 40% од прокариотските и 65% од еукариотските белковини се мултидоменски.^[38]

Многу домени во еукариотските мултидоменски белковини можат да се најдат како независни еднодоменски белковини кај прокариотите,^[39] што укажува на тоа дека домените во мултидоменските белковини некогаш постоеле како независни белковини. На пример, `рбетниците поседуваат мултиензимски полипептид кој содржи GAR синтетаза, AIR синтетаза и GAR трансформилаза домени (GARs-AIRs-GARt; GAR: глицинамид рибонуклеотид синтетаза/трансфераза; AIR: аминоимидазол рибонуклеотид синтетаза). Кај инсектите, овој полипептид се јавува како GARs-(AIRs)2-GARt, кај квасецот GARs-AIRs е кодиран одделено од GARt, а кај бактериите секој домен е кодиран одделно.^[40]

Атрактиноликата белковина 1 (ATRNL1) е мултидоменска белковина која се наоѓа кај животните, вклучувајќи го и човекот.^[41][42] Секоја единица е посебен домен, на пример EGF-сличниот домен и Келч доменот.

Потекло

Мултидоменските белковини, најверојатно, се појавиле како резултат на селективен притисок во тек на еволуцијата за создавање на нови функции. Голем број на белковини имаат дивергирано од заеднички предци по пат на различни асоцијации и комбинации на домени. Модуларните единици често се движат околу, во рамките на, и помеѓу биолошките системи преку механизмите на генетско мешање:

• транспозиција на мобилни елементи, вклучувајќи и хоризонтални трансфери (помеѓу видови);^[43]
• големи преуредувања како што се инверзии, транслокации, бришења и дупликации;
• хомологна рекомбинација;
• слизнување на ДНК-полимеразата за време на репликацијата.

Типови на организација

Вметнување на слични PH (анг. Pleckstrin homology) доменски модули (темноцрвено) во две различни белковини.

Наједноставната мултидоменска организација кај белковините е тандемското повторување на еден домен.^[44] Домените можат да стапуваат во интеракции едни со други (домен-домен интеракција) или да останат изолирани. Џиновската мускулна белковина титин, со 30.000 аминокиселински остатоци, содржи околу 120 фибронектин тип III и Ig-тип домени.^[45] Кај серинските протеази, генска дупликација довела до формирање на ензим со два β-цилиндар домена.^[46] Дупликатите толку многу дивергирале во текот на еволуцијата што не постои очигледна сличност во нивните низи. Активното место се наоѓа во расцеп помеѓу двата β-цилиндар домени, во кој се наоѓаат функционалните аминокиселински остатоци кои потекнуваат и од двата домена. Мутанти на химотрипсинската серинска протеаза, добиени со генетско инженерство, се покажало дека поседуваат одредена активност на белковинаази, иако функционалните аминокиселински остатоци на активното место биле изгубени. Поради тоа, се претпоставува дека појавата на дупликација во еволуционата историја на овој ензим ја зајакнала неговата активност.^[46]

Модулите често покажуваат различни односи на поврзување, каков што е случајот кај кинезините и ABC-транспортерите. Моторниот домен кај кинезинот може да се наоѓа на било кој од краевите во полипептидната верига, кој вклучува регион на намотана завојница и карго домен.^[47] ABC-транспортерите се изградени од најмногу четири домени, кои се состојат од два несродни модули, ATP-врзувачка касета и интегрално-мембрански модул, аранжирани во различни комбинации.

Не само што домените се рекомбинираат, туку има многу примери за вметнување на еден домен во друг. Сличностите во низата или структурата со другите домени покажало дека хомолози на вметнатите и родителските домени можат независно да постојат. Примери за ова се „прстите“ вметнати во доменот „дланка“ во рамките на полимеразите од Pol I фамилијата.^[48] Бидејќи еден домен може да биде вметнат во друг, секогаш треба да постои барем еден континуиран домен во мултидоменска белковина. Ова е главната разлика помеѓу дефинициите за структурни домени и еволуциони/функционални домени. Еволуциониот домен е ограничен на една или две врски помеѓу домените, додека структурните домени можат да имаат неограничени врски, во даден критериум за постоење на заедничко јадро. Неколку структурни домени можат да бидат припишани на еден еволуционен домен.

Супердомен се состои од два или повеќе сочувани домени со номинално независно потекло, но потоа наследени како една структурна/функционална единица.^[49] Овој комбиниран супердомен може да се јави кај различни белковини кои не се сродни само преку процесот на генска дупликација. Пример за супердомен е белковинска тирозинска фосфатаза-C2 домен (PTP-C2) парот кај PTEN (анг. phosphatase and tensin homolog), тензин, ауксилин и мембранската белковина TPTE2. Овој супердомен се среќава во белковините на животните, растенијата и габите. Клучната одлика на супердоменот PTP-C2 е сочуваноста на аминокиселинските остатоци во интерфејсот на доменот.

Домените се автономни единици на склопување

Склопување

Од времето на истражувањата на Анфинсен во раните 1960-ти години,^[17] целта потполно да се разбере механизмот со кој полипептидот бргу се склопува во својата стабилна природна конформација останува неостварена. Мноштвото на експериментални студии на склопување на белковините придонесоа многу за нашето разбирање на овој процес, но принципите според кои се регулира склопувањето сè уште се засноваат на оние откриени во времето на првите студии на склопувањето. Анфинсен покажал дека нативната состојба на белковината е термодинамички стабилна, а конформацијата е во глобалниот минимум на нејзината слободна енергија.

Склопувањето е насочена потрага по конформациски простор, што ѝ овозможува на белковината да се склопи за временски период кој е релевантен од биолошка гледна точка. Парадоксот на Левинтал наведува дека доколку белковина со просечна големина ги проверува сите можни конформации пред да ја најде онаа со најниска слободна енергија, тогаш процесот би траел милијарди години.^[50] Белковините типично се склопуваат во рок од 0.1 до 1000 секунди. Затоа, процесот на склопување на белковините мора на некој начин да е насочен да минува низ специфичен пат на склопување. Силите кои го насочуваат склопувањето по одреден пат најверојатно се комбинација на локални и глобални влијанија чии ефекти се чувствуваат во различни фази од реакцијата.^[51]

Напредокот во експерименталните и теоретските студии покажа дека склопувањето на белковините може да се разгледува во однос на енергетските површини,^[52][53] каде кинетиката на склопувањето се смета за прогресивна организација на комплет од делумно склопени структури низ кои белковината минува на патот кон склопената структура. Ова е опишано во однос на „инка на склопување“, во која несклопената белковина има голем број на достапни конформациски состојби, а склопената белковина има помалку достапни конформациски состојби. Шематскиот приказ на инката на склопување укажува на тоа дека за склопување на белковините потребно е намалување на слободната енергија и на ентропијата. Локалната нерамност на инката ги означува кинетичките стапици кои одговараат на акумулацијата на погрешно склопените интермедиери. Ланецот на склопување напредува кон пониски слободни енергии помеѓу нишките на полипептидот со што се зголемува неговата компактност. Конформационите опции на синџирот сè повеќе се стеснуваат, што на крајот води до една нативна структура.

Предност на домените во склопувањето на белковините

Организацијата на големите белковини со структурни домени претставува предност за склопувањето на белковините, бидејќи секој домен може поединечно да се склопи, со што се забрзува процесот на склопување и се намалува потенцијално големата вредност на комбинациите од интеракции на аминокиселинските остатоци. Понатаму, имајќи ја предвид случајната дистрибуција на хидрофобните остатоци во белковините,^[54] формирањето на домените изгледа како оптимално решение за голема белковина да може да ги ориентира своите хидрофобни остатоци кон внатрешноста на молекулата, а хидрофилните остатоци да ги ориентира кон надворешноста.^[55][56]

Сепак, улогата на интеракциите помеѓу домените во склопувањето на белковините и во енергетиката на стабилизацијата на нативната структура, веројатно е различна за секоја посебна белковина. Кај Т4 лизозимот, влијанието на еден домен врз друг е толку силно што целата молекула е отпорна на протеолитичко раскинување. Во овој случај, склопувањето е низијален процес, каде е потребно, во раните чекори од процесот, C-терминалниот домен самостојно да се склопи, а за склопување и стабилизација на другиот домен потребно е присуство на веќе склопен C-терминален домен.^[57]

Утврдено е дека склопувањето на изолиран домен се одвива со иста, или некогаш поголема, брзина од склопувањето на интегриран домен,^[58] што укажува дека за време на склопувањето можат да се јават неповолни интеракции меѓу тој домен и остатокот од белковината. Постојат докази дека најбавниот чекор во склопувањето на големите белковини е спарувањето на склопените домени.^[27] Случајот е ваков или поради тоа што домените не се потполно правилно склопени или поради тоа што малите прилагодувања потребни за нивна интеракција се енергетски неповолни, како што е отстранувањето на вода од интерфејсот на домените.

Домени и флексибилност на белковините

Присуството на повеќе домени во белковините доведува до голема флексибилност и подвижност, односно динамика на белковинскиот домен.^[59] Движењата на домените можат да се забележат преку споредување на различните структури на истата белковина (како во базата на податоци за молекуларни движења), или тие можат директно да се набљудуваат со употреба на спектри^[60][61] добиени со неутронско спинска ехо спектроскопија. Тие, исто така, можат да бидат предложени преку земање примероци во екстензивни молекуларно динамички траектории^[62] и со анализа на главните компоненти.^[63] Движењата на домените се важни за:^[64]

• катализа^[65]
• регулаторна активност
• транспорт на метаболити
• формирање на белковински агрегати^[66]
• клеточна локомоција

Едно од најголемите набљудувани движења на белковински домен е механизмот на „вртење“ кај пируват фосфат дикиназата. Фосфоинозитид доменот се врти помеѓу две состојби за да пренесе фосфатна група од активното место на нуклеотид-врзувачкиот домен до фосфоенолпируват/пируват доменот.^[67] Фосфатната група се пренесува на растојание од 45 Å, што вклучува придвижување (вртење) на доменот за приближно 100° околу еден аминокиселински остаток. Кај ензимите, затворањето на еден домен во однос на друг предизвикува врзување на супстратот со индуцирана спрега, што овозможува реакцијата да се одвива на контролиран начин. Деталната анализа на Герштајн доведе до класификација на два основни типа на движење на домените; движење на отворање и затворање како шарка на врата и движење на отворање и затворање како лизгањето кај ножиците.^[64] Само мал дел од полипептидната верига, имено меѓудоменскиот линкер и страничните ланци, подлежат на значителни конформациски промени по преуредувањето на доменот.^[68]

Дефиниција за домен од структурни координати

Значајноста на домените како структурни градбени единици и елементи на еволуција довела до развојот на мноштво автоматизирани методи за нивна идентификација и класификација во белковините со позната структура. Автоматските процедури за веродостојно детерминирање на домените се од суштинско значење за создавањето на бази на податоци за домени, особено поради растечкиот број на познати белковински структури. Иако границите на еден домен можат да се утврдат со визуелна инспекција, конструкцијата на автоматизиран метод не е едноставна. Проблеми се јавуваат кога станува збор за домени кои се дисконтинуирани или значително асоцирани.^[69] Фактот што не постои стандардна дефиниција за тоа што навистина претставува белковински домен доведе до големи варијации во детерминирањето на домените, така што секој истражувач користел различни критериуми.^[70]

Структурен домен е компактна, глобуларна подструктура со повеќе внатрешни интеракции отколку интеракции со остатокот од белковината.^[68] Затоа, структурниот домен може да се одреди со две визуелни одлики: неговата компактност и неговиот степен на изолација.^[71] Во многу од раните методи за детерминирање на домени биле употребувани мерења за локална компактност,^{[72][73][74][75]} а истите се употребуваат и во некои од поновите методи.^{[25][76][77][78][79]}

Поврзано

• Краток линеарен мотив
• Белковини
  • Структура на белковините
  • Предвидување на белковинската структура
  • Софтвер за предвидување на белковинската структура
  • Белковинско натсемејство
  • Белковинско семејство
  • Белковинско потсемејство
• Структурна биологија
• Структурна класификација на белковините (SCOP)
• CATH