Circulerende tumorcel

Een circulerende tumorcel (Engels: Circulating tumor cell (CTC)) is een kankercel afkomstig van een primaire tumor die zich heeft verspreid naar het bloed van de bloedsomloop of de lymfe van het lymfevatenstelsel.^[1] CTC's worden door het lichaam naar andere organen getransporteerd, waar ze de bloedsomloop of het lymfevatenstelsel kunnen verlaten en de kiem kunnen vormen voor de daaropvolgende groei van secundaire tumoren.^[2][1] Dit staat bekend als metastase, verantwoordelijk voor de meeste sterfgevallen door kanker.^[3]

Circulerende tumorcellen (HD-CTC's) van een Stanford-patiënt met stadium I longkanker, getoond met behulp van immunofluorescentie (A) en Wright-Giemsakleuring helderveldmicroscopie (B). HD-CTC's worden gekarakteriseerd als 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI)-positief met een kern die groter is dan de omliggende witte bloedcellen (blauw, C), cytokeratine (CK)-positief (rood, D) en CD45-leukocytenmarker-negatief (groen, E).

Een illustratie van de primaire tumor (in de vorm van een tumormicro-omgeving) en de circulerende tumorcellen.

De detectie en analyse van CTC's kan bijdragen aan een vroege prognose van patiënten en het bepalen van passende behandelingen op maat.^[4] Momenteel is er één door de Food and Drug Administration goedgekeurde methode voor CTC-detectie, CellSearch, die wordt gebruikt voor de diagnose van borst-, darmkanker en prostaatkanker.^[5]

De detectie van CTC's, of vloeibare biopsieën, biedt verschillende voordelen ten opzichte van traditionele weefselbiopsieën. Ze zijn niet-invasief, kunnen herhaaldelijk worden gebruikt en leveren meer bruikbare informatie op over het risico op metastasering, de ziekteprogressie en de effectiviteit van de behandeling..^[6][7] Zo is uit analyse van bloedmonsters van kankerpatiënten gebleken dat er een neiging is tot verhoogde CTC-detectie naarmate de ziekte vordert.^[8] Bloedonderzoek is eenvoudig en veilig uit te voeren en er kunnen in de loop van de tijd meerdere monsters worden afgenomen. Daarentegen vereist de analyse van tumoren invasieve procedures die de therapietrouw van de patiënt kunnen beperken. Het vermogen om de ziekteprogressie in de loop van de tijd te monitoren, zou een passende aanpassing van de therapie van een patiënt kunnen vergemakkelijken, wat mogelijk hun prognose en kwaliteit van leven verbetert. Het belangrijke aspect van het vermogen om de toekomstige progressie van de ziekte te voorspellen, is het (ten minste tijdelijk) elimineren van de noodzaak van een operatie wanneer de herhaalde CTC-aantallen laag zijn en niet toenemen; de voor de hand liggende voordelen van het vermijden van de operatie omvatten het vermijden van het risico dat verband houdt met de aangeboren tumorgeniciteit van kankeroperaties. Daartoe zijn recentelijk technologieën ontwikkeld met de vereiste gevoeligheid en reproduceerbaarheid om CTC's te detecteren bij patiënten met uitgezaaide kanker.^{[9][10][11][12][13][14][15][16]} Aan de andere kant zijn CTC's zeer zeldzaam en komen ze vaak voor als slechts enkele cellen per milliliter bloed, wat hun detectie bemoeilijkt. Bovendien scheiden ze vaak een verscheidenheid aan markers uit die van patiënt tot patiënt verschillen, wat het moeilijk maakt om technieken te ontwikkelen met een hoge sensitiviteit en specificiteit.

Typen

CTC's die afkomstig zijn van carcinomen (kankers van epitheliale oorsprong, die het meest voorkomen) kunnen worden geclassificeerd op basis van de expressie van epitheliale markers, hun grootte en of ze apoptotisch zijn. Over het algemeen zijn CTC's anoikis-resistent, wat betekent dat ze in de bloedbaan kunnen overleven zonder zich aan een substraat te hechten.^[17]

• Traditionele CTC's worden gekenmerkt door een intacte, levensvatbare celkern; de expressie van EpCAM en cytokeratines, wat wijst op een epitheliale oorsprong; de afwezigheid van CD45, wat aangeeft dat de cel niet van hematopoëtische oorsprong is; en hun grotere omvang, onregelmatige vorm of subcellulaire morfologie.^[18]
• Cytokeratine-negatieve CTC's worden gekenmerkt door een gebrek aan EpCAM of cytokeratines, wat kan wijzen op een ongedifferentieerd fenotype (circulerende kankerstamcellen) of de verwerving van een mesenchymaal fenotype (bekend als epitheliale-mesenchymale overgang of EMT). Deze populaties CTC's zijn mogelijk het meest resistent en het meest vatbaar voor metastasering. Ze zijn ook moeilijker te isoleren omdat ze noch cytokeratines noch CD45 tot expressie brengen. Verder zijn hun morfologie, genexpressie en genomica vergelijkbaar met die van andere kankercellen.^[19]
• Apoptotische CTC's zijn traditionele CTC's die apoptose (geprogrammeerde celdood) ondergaan. Deze kunnen worden gebruikt om de respons op de behandeling te monitoren, zoals experimenteel is gedaan met de Epic Sciences-methode, die nucleaire fragmentatie of cytoplasmatische blaarvorming in verband met apoptose identificeert. Het meten van de verhouding tussen traditionele CTC's en apoptotische CTC's – vanaf begin tot therapie – geeft inzicht in de effectiviteit van de behandeling bij het aanpakken en doden van kankercellen.^[19]
• Kleine CTC's zijn cytokeratinepositief en CD45-negatief, maar hebben afmetingen en vormen die vergelijkbaar zijn met die van witte bloedcel'len. Belangrijk is dat kleine CTC's kankerspecifieke biomarkers hebben die ze als CTC's identificeren. Kleine CTC's zijn in verband gebracht met progressieve ziekte en differentiatie tot kleincellige carcinomen, waarvoor vaak een ander behandelplan nodig is.^[20]

CTC-clusters

Circulerende tumorcellen en CTC-clusters bij borstkanker

Circulerende tumorcellen zijn meestal aanwezig in clusters.^[21] CTC-clusters zijn aggregaten van twee of meer circulerende tumorcellen (CTC's) die aan elkaar gebonden zijn. Deze clusters kunnen bestaan uit traditionele, kleine of cytokeratine-negatieve CTC's en dragen kankerspecifieke biomarkers die ze onderscheiden van andere cellen in de bloedsomloop. Studies hebben aangetoond dat CTC-clusters geassocieerd zijn met een verhoogd metastatisch potentieel en een slechte prognose. Onderzoek heeft bijvoorbeeld aangetoond dat patiënten met prostaatkanker die slechts één CTC hebben een acht keer hogere gemiddelde overlevingskans hebben in vergelijking met patiënten met CTC-clusters. Soortgelijke bevindingen zijn ook gerapporteerd voor darmkanker.^[22][23]

Er zijn twee soorten circulerende tumorcelclusters; een cluster die uitsluitend uit kankercellen bestaat, wordt homotypisch genoemd. Een CTC-cluster die ook andere cellen omvat, waaronder witte bloedcellen, fibroblasten, endotheelcellen (d.w.z. cellen die het binnenoppervlak van bloedvaten bekleden) en bloedplaatjes, wordt heterotypisch genoemd.^[24] Heterotypische clusters staan ook bekend als micro-embolieën. Er wordt gesuggereerd dat deze micro-embolieën het metastatische potentieel kunnen versterken.^[21]

De kanker-exodushypothese suggereert dat CTC-clusters intact blijven gedurende het metastaseringsproces, in plaats van te dissociëren tot afzonderlijke cellen, zoals eerder werd aangenomen. Volgens deze hypothese komen de clusters de bloedbaan binnen, reizen ze als een samenhangende eenheid en verlaten ze de bloedbaan op verre metastaseringslocaties zonder uiteen te vallen. Dit stelt de clusters in staat hun multicellulariteit te behouden, wat hun metastatische efficiëntie verbetert. De hypothese stelt dat het overlevingsvoordeel dat wordt geboden door intercellulaire ondersteuning binnen clusters hun metastatische potentieel vergroot in vergelijking met afzonderlijke CTC's.^[22][24]

CTC-clusters vertonen verschillende genexpressieprofielen, die resistentie verlenen tegen bepaalde kankertherapieën, waardoor ze veerkrachtiger zijn dan individuele tumorcellen. Hun vermogen om multicellulair te blijven gedurende de metastasering, zou hun superieure overleving en metastatische potentieel kunnen verklaren.^[25]

Het onderzoek naar CTC-clusters en hun rol in metastasering blijft zich ontwikkelen, waarbij de kanker-exodushypothese een nieuw perspectief biedt op hoe deze clusters bijdragen aan de progressie van kanker. Het detecteren en analyseren van CTC-clusters levert cruciale prognose-informatie op en kan helpen bij het nemen van therapeutische beslissingen voor kankerpatiënten.^[26]

Aantal CTC's in het bloed

Aantal verschillende typen cellen in het bloed.

De detectie van CTC's kan belangrijke prognostische en therapeutische implicaties hebben, maar omdat hun aantal zeer klein kan zijn, zijn deze cellen niet gemakkelijk te detecteren.^[27] Geschat wordt dat van de cellen die zich van de primaire tumor hebben losgemaakt, slechts 0,01% metastasen kan vormen.^[28]

CTC's worden aangetroffen in frequenties van de orde van 1-10 CTC's per ml bloed bij patiënten met uitgezaaide kanker.^[29] Ter vergelijking: een ml bloed bevat een paar honderd CEC's (d.w.z. circulerende endotheelcellen), een paar miljoen witte bloedcellen en een miljard rode bloedcellen. Deze lage aantallen, die gepaard gaat met de moeilijkheid om kankercellen te identificeren, betekent dat een belangrijk onderdeel van het begrijpen van de biologische eigenschappen van CTC's technologieën en benaderingen vereist die in staat zijn om 1 CTC per ml bloed te isoleren, hetzij door verrijking, of beter nog met verrijkingsvrije assays die alle CTC-subtypen identificeren met hoge resolutie om te voldoen aan de eisen van diagnostische pathologische beeldkwantiteit bij patiënten met diverse soorten kanker.^[19] Tot op heden zijn CTC's gedetecteerd in verschillende epitheliale kankers (borst-, prostaat-, long- en darmkanker)^{[30][31][32][33]} en klinisch bewijs wijst erop dat bij patiënten met gemetastaseerde laesies vaker CTC's geïsoleerd worden.

CTC's worden uit de bloedvaten geïssoleerd met behulp van specifieke antilichamen die specifieke tumormarkers kunnen herkennen (meestal EpCAM); deze benadering is geeft echter een vertekend beeld door de noodzaak van voldoende expressie van het geselecteerde eiwit op het celoppervlak, noodzakelijk voor de verrijkingsstap. Bovendien zijn nieuwe verrijkingsstrategieën nodig, omdat EpCAM en andere eiwitten (bijv. cytokeratines) in sommige tumoren niet tot expressie komen en tijdens de epitheliale-mesenchymale overgang (EMT) kunnen worden onderdrukt.^[34]

Eerste bewijzen wijzen erop dat CTC-markers die in de humane geneeskunde worden gebruikt, ook bij andere diersoorten voorkomen. Vijf van de meest voorkomende markers, waaronder CK19, zijn ook nuttig voor de detectie van CTC in het bloed van honden met kwaadaardige melkkliertumoren.^[35][36] Nieuwere methoden, zoals IsofFux of Maintrac, kunnen meer cellen identificeren in 7,5 ml bloed.^[37][38] In zeer zeldzame gevallen zijn CTC's in voldoende grote hoeveelheden aanwezig om zichtbaar te zijn bij een routinematig bloeduitstrijkje. Dit wordt carcinocytemie genoemd en gaat gepaard met een slechte prognose.^[39]

Detectiemethoden

Tot nu toe zijn er diverse onderzoeksmethoden ontwikkeld om CTC's te isoleren en te tellen.^[40] De enige door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurde methodologie voor het tellen van CTC in bloed is het CellSearch-system.^[41] Uitgebreide klinische tests met deze methode tonen aan dat de aanwezigheid van CTC's een sterke voorspelbare factor is voor de totale overleving bij patiënten met gemetastaseerde borst-, darm- of prostaatkanker.^{[8][42][43][44][45][46][47]}

CTC's zijn cruciaal voor het begrijpen van de biologie van metastasen en beloven potentieel als biomarker om tumorprogressie en respons op behandeling niet-invasief te evalueren. Isolatie en karakterisering van CTC's vormen echter een grote technologische uitdaging, aangezien CTC's een klein aantal van het totale aantal cellen in circulerend bloed uitmaken, 1–10 CTC's per ml volbloed, vergeleken met een paar miljoen witte bloedcellen en een miljard rode bloedcellen.^[48] Daarom is de grootste uitdaging voor CTC-onderzoekers de heersende moeilijkheid van CTC-zuivering die de moleculaire karakterisering van CTC's mogelijk maakt. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om CTC's in het perifere bloed te isoleren en deze vallen in wezen in twee categorieën: biologische methoden en fysische methoden, evenals hybride methoden die beide strategieën combineren. Technieken kunnen ook worden geclassificeerd op basis van of ze CTC's selecteren voor isolatie (positieve selectie) of dat ze alle bloedcellen uitsluiten (negatieve selectie).

Karakterisering van CTC

Sommige geneesmiddelen zijn bijzonder effectief tegen kankers die aan bepaalde eisen voldoen. Trastuzumab is bijvoorbeeld zeer effectief bij patiënten die HER2/neu-positief zijn, maar veel minder effectief bij patiënten die HER2/neu-negatief zijn. Zodra de primaire tumor is verwijderd, is biopsie van de huidige toestand van de kanker via traditionele weefseltypering niet meer mogelijk.^[49] Vaak worden weefselcoupes van de primaire tumor, die jaren eerder zijn verwijderd, gebruikt voor de typering. Verdere karakterisering van CTC kan helpen bij het bepalen van het huidige tumorfenotype. FISH-tests zijn uitgevoerd op CTC, evenals bepaling van de IGF-1R-, Her2-, Bcl-2-, ERG-, PTEN- en AR-status met behulp van immunofluorescentie.^{[7][50][51][52][53]} qPCR op enkelvoudig celniveau kan ook worden uitgevoerd met de uit bloed geïsoleerde CTC's.

De voorkeur voor een bepaald orgaan van patiënt-afkomstige CTC is onderzocht in een muizenmodel.^[54] CTC's die geïsoleerd werden van borstkankerpatiënten en in vitro werden vermenigvuldigd, toonden aan dat ze bot-, long-, eierstok- en hersenmetastasen konden genereren bij muizen, wat gedeeltelijk de secundaire laesies weerspiegelde die bij de overeenkomstige patiënten werden aangetroffen. Opmerkelijk genoeg was één CTC-lijn – lang geïsoleerd voordat hersenmetastasen bij de patiënt verschenen – zeer competent in het genereren van hersenmetastasen bij muizen. Dit was de eerste voorspellende casus voor hersenmetastasen en een proof of concept dat intrinsieke moleculaire kenmerken van metastatische precursors tussen CTC's nieuwe inzichten konden bieden in de mechanismen van metastasen.

Celmorfologie

Het morfologisch uiterlijk wordt beoordeeld door menselijke analisten en is daarom onderhevig aan grote variatie tussen analisten.^[55] Er bestaan verschillende CTC-telmethoden die het morfologisch uiterlijk gebruiken om CTC te identificeren, waarbij ook verschillende morfologische criteria kunnen worden gehanteerd. Uit een recent onderzoek naar prostaatkanker is gebleken dat veel verschillende morfologische definities van circulerende tumorcellen een vergelijkbare voorspellende waarde hebben, ook al varieerde het absolute aantal cellen dat bij patiënten en normale donoren werd aangetroffen met meer dan een decennium tussen de verschillende morfologische definities.^[56]